[发明专利]基于CRISPR/Cas9的小菜蛾ABCC3基因的敲除和应用

说明书

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9实现非模式生物小菜蛾ABCC3基因的敲除及其在Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性机制分子研究中的应用。本发明方法设计并合成小菜蛾ABCC3基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统筛选出可稳定遗传的小菜蛾ABCC3基因纯合突变种群并用于Bt Cry1Ac杀虫蛋白毒力生物测定，证实小菜蛾ABCC3基因突变可以导致其对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生高抗性。本发明方法简单高效，省时省力，不仅为非模式生物体内功能基因的深入研究提供技术支撑，也为探索新的害虫防治策略奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及小菜蛾ABCC3基因的敲除以及在小菜蛾BtCry1Ac杀虫蛋白抗性分子机制研究中的应用。

背景技术

小菜蛾(Diamondback moth, Plutella xylostella)属于鳞翅目，菜蛾科，又名菜蛾，吊丝虫，是一种世界性分布的重要害虫。它主要危害十字花科蔬菜，如甘蓝、芥兰、花椰菜、芥菜、大白菜和萝卜等，严重发生时蔬菜能减产90%以上，甚至绝收，每年在世界范围内引起40-50亿美元的经济损失。小菜蛾的危害之所以如此严重是因为其极易对杀虫剂产生抗药性，目前小菜蛾已经对50多种杀虫剂产生不同程度的抗药性，抗性谱极广，田间化学防治十分困难。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)能产生Cry类杀虫晶体蛋白，对多种昆虫具有特异性毒杀作用，鉴于Bt制剂环境友好，高效无毒，目前已被广泛应用于蔬菜害虫的防治，而且编码Bt杀虫蛋白的基因也已被转入到多种重要的粮棉作物中。但是，由于人们对Bt毒理机制认识的局限性以及Bt的大量和不合理使用导致害虫对该生物源杀虫剂产生非常严重的抗性，其中，小菜蛾是最早被报道在田间对Bt制剂产生抗性的害虫，因此，寻找合理的科学手段研究小菜蛾Bt抗性分子机制，从根本上解决害虫抗药性问题就显得尤为重要。

ABC转运蛋白(ABC transporter)是一个基因超家族，它广泛分布于各种生物中，并在昆虫抗药性中发挥重要作用，以前的报道指出，昆虫ABC transporter有ABCA到H共8个亚家族，其中ABCB、ABCC、ABCG家族基因在昆虫抗药性中存在重要作用。Park等在2014年证明在甜菜夜蛾中沉默ABCC3基因的表达，会增加甜菜夜蛾对Cry1Ac的耐受性。本申请人实验室于2015年证明在敏感小菜蛾种群中使用RNA干扰（RNAi）技术下调ABCC2和ABCC3基因的表达会增加小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素的抗性水平。