[发明专利]一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法

权利要求书

1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的层析方法，依次包括以下步骤：

1) 从重组人纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中提取含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液；

2) 将含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液经阳离子交换层析，得到初级产物；

3) 将所述初级产物经阴离子交换层析，得到纯化的重组人纤维连接蛋白目标物；

其中所述阳离子交换层析介质为纳微Nano Gel 50 SP阳离子交换填料，层析步骤为：

1a) 采用5-15倍柱体积的组分为10-50 mM PB，0-120 mM NaCl，pH为6.8-7.1的平衡缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；

1b) 以步骤1)的蛋白粗提取液作为上样样品，其中样品电导为2.5-13.5 ms/cm，pH为6.8-7.1；

1c)采用组分为10-50 mM PB，130-200 mM NaCl，pH为6.8-7.1的洗杂缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱杂蛋白，洗杂缓冲液体积为20-40倍柱体积；

1d)采用组分为10-50 mM PB，250-300 mM NaCl，pH为6.8-7.1的洗脱缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱样品，所得洗脱液为初级产物；或者

所述阳离子交换层析介质为博格隆SP Bestarose HP阳离子交换填料，层析步骤为：

1aa) 采用5-15倍柱体积组分为10-50 mM PB，pH为 6.8-7.1的平衡缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；

1bb) 以步骤1)的蛋白粗提取液作为上样样品，其中样品电导为2.5 ms/cm，pH为6.8-7.1；

1cc) 用1aa) 中的平衡缓冲液20-40倍柱体积进行再平衡，采用组分为10-50 mM PB，100-130 mM NaCl，pH为5.8-6.1的洗杂缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱杂蛋白；

1dd)用组分为10-50 mM PB，90-110 mM NaCl，pH为6.8-7.1的洗脱缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱样品，所得洗脱液为初级产物;

所述阴离子交换层析介质为博格隆Q Bestarose FF或汇研Q HP阴离子交换填料，层析步骤为：

2a) 采用5-15倍柱体积的平衡缓冲液，以50-200 cm/小时的流速平衡层析柱，平衡缓冲液的组分为10-50 mM PB，0-150 mM NaCl，pH为6.8-7.1；

2b) 以步骤2)的初级产物作为上样样品，其中样品电导为12.5-17.6 ms/cm，pH为6.8-7.1；

2c) 采用组分为10-50 mM PB，200-220 mM NaCl，pH为6.8-7.1的洗杂缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱杂蛋白；

2d) 采用组分为10-50 mM PB，250-300mM NaCl，pH为6.8-7.1的洗脱缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱样品，所得洗脱液为终级产物；

其中步骤 1) 所述重组人纤维连接蛋白粗提取液是通过下述方法制备，包括步骤 ：

a) 以表达重组人纤维连接蛋白的基因工程水稻种子为原料，将稻谷脱壳抛光成半精米并研磨成80-100目的米粉；

b) 将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5-1:10的比例混合，常温下提取0.5-2小时，获得蛋白粗提取物；所述提取缓冲液为：10-50mM PB，含有0.8-1mM PMSF、5-10mM GSH和0.05-0.1% Tween 80，pH 5.9-8.0;

c) 将粗蛋白提取物过滤，得到含重组人纤维连接蛋白的粗提取液；

其中用于制备所述的基因工程水稻种子的植物表达载体是将如SEQ ID NO.1所示的表达人纤维连接蛋白的基因与水稻特异性启动子 Gt13a 及其信号肽导入质粒载体构建，质粒载体为pOsPMP626。