[发明专利]一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人表皮细胞生长因子的方法

权利要求书

1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人表皮细胞生长因子的层析方法，依次包括以下步骤：

1)从重组人表皮细胞生长因子的基因工程水稻种子中提取含有重组人表皮细胞生长因子的粗提取液，包括步骤：

1a)以含有重组人表皮细胞生长因子的基因工程水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80-100目的米粉；

1b)将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积比为1:5-1:10的比例混合，常温下提取0.5-2小时,获得混合物；所述提取缓冲液含有10-50mM Tris、10-50mM NaAC，10-50mM PB，0-250mM NaCl，pH为4.0-8.0；

1c)将混合物过滤，得到含重组人表皮细胞生长因子的粗提取液；

2)将含有重组人表皮细胞生长因子的粗提取液经阳离子交换层析，得到初级产物I，所述阳离子交换层析介质为SP Bestarose FF阳离子交换填料，层析步骤为：

2a)采用5-15倍柱体积的pH为3.9-4.5的10-50mM NaAc，0-95mM NaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；

2b)以步骤1)的粗提取液作为上样样品，其中样品电导为2-11ms/cm，pH为3.9-4.5；

2c)用pH为3.9-4.5的10-50mM NaAc，90-255mM NaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱样品，收集洗脱液即为初级产物I；

3)将初级产物I经阴离子交换层析，收集含有重组人表皮细胞生长因子的中级产物II，所述阴离子交换层析介质为Q Bestarose FF阴离子交换填料，层析步骤为：

3a)采用5-15倍柱体积的pH为7.5-8.0的10-50mM Tris，0-110mM NaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；

3b)以所述步骤2)的初级产物I作为上样样品，其中样品电导为2.0-11ms/cm，pH为7.5-8.0；

3c)用pH为7.5-8.0的10-50mM Tris，70-145mM NaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱杂蛋白；

3d)用pH为7.5-8.0的10-50mM Tris，100-210mM NaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱目标蛋白，收集洗脱液即为中级产物II；

4)将中级产物II经疏水层析或浓缩后经分子筛层析，得到纯化的重组表皮细胞生长因子目标物，所述疏水层析介质为Phenyl Bestarose HP，层析步骤为：

4a)采用5-15倍柱体积的pH为7.0-7.5，含有10-50mM PB，1-1.5M硫酸铵的缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；

4b)以步骤3)的中级产物II作为上样样品，调节样品的硫酸铵浓度至1-1.5M，pH为7.0-7.5；

4c)用4a)中的平衡液5-15倍柱体积再平衡；

4d)用pH为7.0-7.5的10-50mM PB缓冲液，设置洗脱梯度为0-100％B，15min，以50-200cm/小时的流速洗脱目标蛋白，得到纯化的重组人表皮细胞生长因子的目标物；或者

所述分子筛层析介质为Chromdex 75pg，层析步骤为：

4aa)采用5-15倍柱体积的pH为7.0-7.5的10-50mM PB，150-300mM NaCl缓冲液，以30-60cm/小时的流速平衡层析柱；

4bb)以步骤3)的中级产物II经层析浓缩后作为上样样品进行上样，pH为7.0-7.5；

4cc)采用pH为7.0-7.5的10-50mM PB，150-300mM NaCl缓冲液，以30-60cm/小时的流速再平衡层析柱，收集洗脱液得到纯化的重组人表皮细胞生长因子的目标物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4bb)中的浓缩方式选用Phenyl疏水层析或阴离子交换层析。