[发明专利]热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体K203E及其基因和应用

说明书

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种真菌来源的酸性蛋白酶Bs2688突变体及其基因和应用。本发明蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明提供了一个新的蛋白酶基因，实现利用基因工程手段生产性质优良的蛋白酶，可应用于饲料、食品、医药等工业。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种真菌来源的热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体及其基因和应用。

背景技术

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，其在植物、动物和微生物中都有广泛存在。相比于动植物来源的蛋白酶，微生物源蛋白酶，具有培养方便、操作简单和产酶量高的特点，便于工业化的批量生产得以大规模生产应用。因此，微生物源蛋白酶成为了目前的蛋白酶的重要来源。

蛋白酶的分类方式有很多，按照蛋白酶作用的pH，将其分成酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。酸性蛋白酶通常在pH 2.0～6.0之间是稳定的，最适pH值随种属不同稍有不同，但通常都在pH 3.0左右，如黑曲霉所产酸性蛋白酶的最适pH为 3.0，灰绿青霉为pH3.5，酵母菌也在pH 3.0。该类酶拥有较高的序列相似性，其三维结构呈对称的双叶型。按活性中心的不同，蛋白酶分为：丝氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

蛋白酶在食品、酿造、毛皮与皮革、医药和饲料等行业中均有广泛应用。乳品行业中，利用凝乳酶对酪蛋白的高度专一性，蛋白酶可以参与奶酪的制造过程。白酒酿造的发酵过程中，利用酸性蛋白酶起协同作用，溶解发酵原料的颗粒，提高原材料的利用率，促进微生物生长，分解蛋白质提供生香前体物质和风味物质，分解酵母菌体蛋白。在毛皮、皮革的制造过程中，酸性蛋白酶将纤维间质除去，使皮质更加柔软、丰满。饲料行业中，酸性蛋白酶的添加可提高蛋白质的可消化性，使高分子的蛋白质降解为低分子的肽及氨基酸，易于畜禽消化吸收，可降低饲料对幼仔消化道的刺激，减少营养障碍，提高饲料利用率，促进畜禽生长。

目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定。因此，酸性蛋白酶的酶活不高，酶自身最适作用条件与所催化的环境条件之间在pH、温度等方面的差别，导致酶的催化效率降低，从而限制了酸性蛋白酶在工业中的应用。

发明内容

为了解决现有的酸性蛋白酶的酶活不高、催化效率低下的问题，本发明提供一种真菌来源的热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体，其具有耐酸、耐高温、易于生产发酵的特点。

本发明的目的是提供一种热稳定提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体。

本发明的再一目的是提供上述蛋白酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述蛋白酶的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述蛋白酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备蛋白酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述蛋白酶的应用。

根据本发明的具体实施方式，酸性蛋白酶Bs2688的氨基酸序列如SEQ ID No.1 所示：

其中，该酶全长407个氨基酸，N端19个氨基酸为信号肽序列，即“MHSFVTAAALVASASLTLA”。因此，蛋白酶原Bs2688的理论分子量为40.3kDa，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：

为进一步提高酸性蛋白酶Bs2688的热稳定性，对其进行了突变改造。75℃下处理5min后，野生型的酶活剩余53％，而突变体K203E的剩余酶活为68％，较野生型有了大幅度的提高。