[发明专利]一株克劳氏芽孢杆菌及使用其生产四氢嘧啶的方法

说明书

本发明涉及一种产四氢嘧啶的克劳氏芽孢杆菌ET01，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16310。本发明还涉及使用该菌株发酵生产四氢嘧啶的方法。本发明的克劳氏芽孢杆菌能够在低盐浓度刺激下产生较高产量的四氢嘧啶，可用于工业发酵生产四氢嘧啶，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于微生物领域，具体而言，本发明涉及一株生产四氢嘧啶的克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)，以及使用该菌株生产四氢嘧啶的应用及方法。

背景技术

四氢嘧啶(Ectoine)是许多耐盐和嗜盐微生物为维持渗透压平衡而在细胞内产生的一种相容性溶质，能够为处于外界高温、冷冻、射线、干燥等极端条件刺激下的细胞、蛋白质、细胞膜和核酸等提供保护作用。此外，四氢嘧啶对阿尔兹海默氏症、帕金森病等神经性疾病均有一定的疗效，并且最新研究发现四氢嘧啶能够提高皮肤的再生能力和延缓皮肤的老化。因此，四氢嘧啶在精细化工和生物医药等行业将具有广泛的应用前景。

目前，四氢嘧啶的生产方法主要通过嗜盐微生物(特别是盐单胞菌)的高密度发酵来获得。通常而言，这个过程通过采用被称为“细菌挤奶法/泌乳法”的方式进行生产，即高渗透压下培养细菌、然后低渗冲击释放溶质、再将菌体重新高渗培养、低渗冲击释放溶质，依次循环多至8-9次，获得产物。该方法对反应器材料的稳定性有较高要求，而且这种不连续的生产流程及高浓度的盐增加了下游纯化工艺的难度，另外高浓度的盐易对设备造成腐蚀，同时还会影响菌体的生长，影响四氢嘧啶的产量，导致生产成本的增加，影响了四氢嘧啶的大规模应用。

目前现有的生产菌株及使用其生产四氢嘧啶的方法严重制约了四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用，因此开发一株新型的四氢嘧啶高产菌株以简化生产工艺、提高合成效率、降低生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义。

克劳氏芽孢杆菌是一种益生菌株，不仅可满足安全性要求较高的生产，而且发酵工艺较为成熟，发酵培养需求简单，还可满足发酵操作简便、成本低的工业应用条件，但是目前的克劳氏芽孢杆菌多用于蛋白酶工业生产，尚未发现将其用于工业生产四氢嘧啶的相关报道。

发明内容

目前现有的四氢嘧啶生产工艺复杂、合成效率低、生产成本高，严重制约了四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用。因此，本发明的目的是提供一株生物安全性高、四氢嘧啶产量高、发酵操作简便且培养成本低廉的生产四氢嘧啶的菌株及其发酵生产四氢嘧啶的方法，以克服现有技术的不足。

在第一方面，本发明提供了一株产四氢嘧啶的克劳氏芽孢杆菌ET01(Bacillusclausii ET01)，保藏编号为CGMCC NO.16310。本发明所述的菌株可在无机盐浓度为0-100g/L的液体培养基中生长，并在低盐浓度(小于100g/L且大于0g/L，例如50g/L)下高产四氢嘧啶(多达25g/L)。

在第二方面，本发明提供了第一方面所述的克劳氏芽孢杆菌ET01在生产四氢嘧啶方面的应用。

在第三方面，本发明提供了一种四氢嘧啶的生产方法，所述方法包括：

将第一方面的克劳氏芽孢杆菌ET01在无机盐浓度小于100g/L的克劳氏芽孢杆菌培养基中进行有氧发酵，从而获得四氢嘧啶。

本发明的有益效果如下：与现有技术中其它产四氢嘧啶菌株(例如CN103451137A中的盐单胞菌)相比，本发明的克劳氏芽孢杆菌ET01具有较高的四氢嘧啶合成能力(25g/L)，可在低盐浓度(小于100g/L)培养条件下发酵生产良好，降低了其它嗜盐菌株在发酵生产中由于盐度过高造成发酵设备腐蚀以及污染环境的风险；使用本发明的克劳氏芽孢杆菌ET01进行有氧发酵后，菌株发酵副产物及其它杂质含量较低，且无羟基嘧啶产生，经简单分离纯化后获得的四氢嘧啶纯度可达98％以上，降低了分离提纯成本，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1是在100倍显微镜下观察到的克劳氏芽孢杆菌ET01。