[发明专利]利用生物反应器生产轮状病毒的方法

说明书

本发明申请涉及轮状病毒的生产方法，尤其是利用潮汐式生物反应器生产轮状病毒的方法，包括Vero细胞的培养和病毒接种和培养，为适应潮汐式生物器的需要，生长液和维持液的配方添加了葡萄糖，潮汐式生物反应器系统原则上与转瓶系统非常的相似，它也是交替的将细胞暴露于空气与营养物质中，然而潮汐式的运动克服了转瓶系统的很多缺点，如劳动力和空间需求以及污染风险。

技术领域

本发明申请涉及轮状病毒的生产方法，尤其是利用潮汐式生物反应器生产轮状病毒的方法。

背景技术

目前，轮状病毒疫苗生产主要采用的是传统的转瓶培养、细胞工厂培养和发酵罐微载体培养。转瓶工艺细胞生长密度低，细胞贴壁不均一，病毒收率低且难以规模化生产。细胞工厂生产工艺由于是静态培养，细胞连续浸没在没有通气的浅培养基中，病毒增殖较慢，病毒收获率低。发酵罐微载体工艺虽然能够通过培养基的连续搅拌以实现营养和氧气的交换，但是这种搅拌会对微载体表面生长的细胞产生剪切应力，引起细胞的死亡，导致产物产量降低并增加了下游工艺生物难度和成本。因此开发新型的生产培养方式已成为一种趋势。

发明内容

本发明公开了一种利用生物反应器生产轮状病毒的方法，包括Vero细胞的培养和病毒接种和培养，其特征在于步骤如下：

步骤1、Vero细胞的培养，将潮汐培养反应器置于二氧化碳培养箱中并将参数调整细胞的接种参数为Up: 2 mm/sec T_H: 20 sec Down: 2 mm/sec B_H: 0 sec ，将回温到37 ℃±0.5℃的 450 ml 细胞生长液倒入体积为500ml的潮汐培养瓶中，然后将细胞分洒在CelCradle-500的载体上，培养5小时，然后进行截留率计算，并调整细胞培养参数；

Vero细胞培养后的72小时进行一次换液，第72小时起，每24小时测量培养液的葡萄糖浓度一次，接近或低于 1 g/L则更换培养液；在整个Vero细胞培养阶段，每2-3天进行载体片取样计数细胞，待细胞数目到达3 x 10⁹个，停止Vero细胞培养；

步骤2、病毒接种和培养，（在步骤1培养Vero细胞的潮汐培养瓶中）加入20ug/ml胰酶和600ug/mlCaCl₂ ，37℃孵育45min；然后用500ml维持液将潮汐培养瓶中的细胞洗1次，；将病毒以MOI0.05接种于潮汐培养瓶，拧紧瓶盖，将瓶子于37℃倒置培养2h；补加维持液至潮汐培养瓶内总的溶液的量为500ml，于37℃培养96小时收液，-20℃冻融一次，8000prm离心20min，去上清，-80℃保存，蚀斑检测病毒滴度。

所述的生长液的配方，其特征在于添加了葡萄糖，具体如下： FBS 100ml；谷氨酰胺4mM；葡萄糖3g/L；双抗 10ml；NaHCO₃25ml；MEM补加至总体积1L。

所述的维持液的配方，其特征在于添加了葡萄糖，具体如下：谷氨酰胺4mM；葡萄糖3g/L；双抗 10ml；NaHCO₃28ml；MEM补加至总体积1L。

与转瓶培养相比较，在潮汐式培养的生长液和维持液中我们添加了葡萄糖。葡萄糖作为糖类物质，能够为细胞的生长提供能量；另一方面由于潮汐式培养的载体较难在显微镜下直接观察细胞的形态，因此我们可以通过直接测定培养液中葡萄糖的浓度来判断细胞的生长状态。当葡萄糖浓度降低至1g/L时，提示我们培养液中营养消耗大，需要添加新的培养液。病毒的接种量MOI大大降低，转瓶培养时MOI为0.5，而潮汐培养时MOI为0.05；也就是接种时病毒的用量大大降低。