[发明专利]一种供药学应用的蛋白酶变体

权利要求书

1.一种供药学应用的蛋白酶变体，其包含序列表中的SEQ ID NO.1氨基酸序列，所述氨基酸序列去除原基因N端前25个氨基酸酶原激活肽段中的前20个氨基酸，N端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点，缩短后的酶原序列经EcoRI和NotI双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点；

所述蛋白酶作为起始分子，通过片段化、缺失诱变、插入诱变、或取代诱变而得，并且包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266个连续相连氨基酸的长度上相应于所述起始分子的氨基酸序列，其中所述起始分子中含有的氨基酸取代R99E或R99D与氨基酸取代S3T、V4I和V199I的组合依然存在，所述蛋白酶的降解由20S核心颗粒中的β亚基进行，其机制被认为是苏氨酸依赖的亲核攻击，这一机制可能需要有一个结合的水分子参与活性的苏氨酸上羟基的去质子化，降解发生在核心颗粒中间的两个β环内的孔道里，一般不生成部分降解的产物，而是将底物蛋白完全降解为长度一定的肽段，肽段的长度一般为7-9个残基。

2.根据权利要求1所述的一种供药学应用的蛋白酶变体，其特征在于：所述蛋白酶活性区氨基酸所在2环及侧翼链，以糖基化识别序列Asn-Xaa-Ser/Thr为模板，选取距离活性位点氨基酸Asp89较近的82位Asn作为拟糖基化位点。

3.根据权利要求1所述的一种供药学应用的蛋白酶变体，其特征在于：所述序列为SEQID NO.1的氨基酸来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87.96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268相关联的一或多个位置引入单个或多个氨基酸取代，其中所述蛋白酶包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与氨基酸取代S3T、V4I和V199I的组合。

4.根据权利要求1所述的一种供药学应用的蛋白酶变体，其特征在于：所述氨基酸酶原激活肽是一种具有多种生物活性的多肽，包括PACAP-38和PACA-27两种，分别由38和27个氨基酸组成，后者的氨基酸顺序与PACAp-38的N端1～27个氨基酸残基完全相同。

5.根据权利要求1所述的一种供药学应用的蛋白酶变体，其特征在于：所述蛋白酶作为起始分子降解的蛋白质会先被连接上泛素作为标记，即蛋白质上的一个赖氨酸与泛素之间形成共价连接，泛素被转移到E1的活性中心的半胱氨酸残基上，并伴随着第二个泛素分子的腺苷酸化。

6.根据权利要求1所述的一种供药学应用的蛋白酶变体，其特征在于：所述β亚基具有共同的降解机制催化活性，而各个β亚基对于底物的特异性却略有不同，并且每一个具有催化活性的β亚基也都含有一个降解所必需的保守的赖氨酸。