[发明专利]水稻抗稻瘟病基因Pi2的SNP标记的开发和应用

说明书

本发明提供了一种与广谱抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的SNP分子标记K_060502，该SNP标记检测水稻第6号染色体第10432612位点处碱基为G或T，基于KASP技术开发的该SNP标记的引物组合为Primer X、Primer Y和Primer C。本发明利用KASP技术对与广谱抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的SNP标记进行基因快速分型，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中；同时开发SNP标记表型的选择效率达到100％，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测广谱抗稻瘟基因Pi2；并且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及溴化乙锭EB(ethidium bromide)等有毒物的使用，可在育种早期进行前景的分子标记辅助选择，减小育种群体的大田种植规模，降低育种成本，加快育种进程。

技术领域

本发明涉及分子标记及作物育种领域，具体的，涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的SNP标记的开发和应用。

背景技术

水稻是中国乃至世界上最重要的粮食作物之一，世界上有一半以上的人口以稻米为主食。稻瘟病被称为水稻的癌症，是对水稻生产危害最严重的病害之一。中国大面积推广的杂交稻，由于缺少远源优质抗病资源的导入，亲本遗传多样性不高，抗病改良是一大瓶颈；在水稻主要种植国家，经常有稻瘟病流行和爆发的报道，每年可造成20-100％的产量损失。

实践证明，选育抗病品种是解决上述问题最为经济、安全、环保、高效的方法。但由于稻瘟菌生理小种致病性变异频繁、群体结构复杂，导致单一抗性品种在种植3～5年后即丧失抗性，因此利用广谱抗病基因培育持久、广谱抗病品种是应对稻瘟病危害的重要途径。

至今，水稻中有25个已克隆的稻瘟病抗性基因，其中大多数抗谱很窄。而来自哥伦比亚籼稻品种5173的Pi2，是一个显性广谱抗稻瘟病基因。Chen等以来源于中国中部和南部稻区的792个生理小种接种携带Pi2基因的水稻近等基因系C101A51，发现C101A51对超过92％的生理小种表现抗性；Liu等研究表明，C101A51对来自13个国家的43个稻瘟菌生理小种中的36个表现抗性；刘士平用不同地区来源的75个稻瘟菌菌株接种发现，Pi2抗谱高达85.53％。因此，Pi2在水稻抗稻瘟病育种中具有重要应用价值，自2006年克隆以来，得到了广泛应用。

与传统育种方法相比，分子标记辅助选择提高了选择的可靠性，加快了育种进度，且不受环境和人员经验影响，近年来越来越多的应用到育种实践中。但Pi2所在的基因簇内，至少存在10个抗病基因(Piz,Piz-t,Pi2,Pi2,Pi9,Pi25,Pi26,Pi40,Pi50,Pi2-2)，它们在序列上高度相似，核苷酸水平上的序列一致性达95.6％；在氨基酸水平上，Pi2与Pi9序列一致性高达96％，Pi2与Piz-t只有8个氨基酸的差异。因此，需要开发一种稳定、可靠、分辨率高的分子标记。

目前已开发的分子标记，一般都需要进行琼脂糖凝胶电泳(邓国富等，CN105462971 B；张明永等，CN106636358 A)，甚至需要更复杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳(陈庆全等，CN 102312000 A；陈松彪等，CN 104073487 B；纪剑辉等，CN 104450932 B；圣中华等，CN106636395 A)，有的还需要酶切后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(华丽霞等，CN 103320437 B)，操作繁琐，费时耗物，不便于规模化鉴定；金名捺等(CN 107435068A)通过高分辨率熔解曲线分析(High Resolution Melting Curve Analysis，HRM)的方法检测SNP(SingleNucleotide Polymorphism)位点，虽然避免了电泳或酶切过程，但随着扩增产物片段增大，检测的准确性和稳定性会逐渐降低。因此，需要开发的标记除了稳定可靠、分辨率高，还要操作简便、高效快速、可直接对碱基进行检测。

发明内容