[发明专利]三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法

说明书

本发明公开了一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real‑time PCR检测引物及方法，检测引物的核苷酸序列为：上游引物Fv‑QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’，下游引物Fv‑QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’；本发明设计轮枝镰刀菌的特异性引物，建立标准曲线用于轮枝镰刀菌的定性定量分子检测和病害准确诊断；利用本发明能快速准确检测三七种植土壤以及三七病株中轮枝镰刀菌的数量动态变化，因而可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及三七种子、种苗的带菌分子检测提供技术支持。

技术领域

本发明涉及一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-time PCR检测引物及其检测方法，专用于三七根腐病菌的快速分子检测，同时可实现田间三七根腐病菌的早期诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害的分子生物学检测技术领域。

背景技术

三七[Panax notoginseng (Burk) F.H. Chen)]为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物，其干燥根及根茎入药，是我国传统名贵中药材；其味甘、微苦、性温，归肝、胃、大肠经，具有化瘀止血、消肿止痛等作用。研究表明其主要成分有三萜类化合物甾醇类、人参炔三醇、黄酮类、糖类、微量元素和氨基酸等(Dawei L, Jiaqing C, Xiuli B, et al.New dammarane-type triterpenoids from the leaves of Panax notoginseng andtheir protein tyrosine phosphatase 1B inhibitory activity . Journal ofGinseng Research , 2014, 38(1): 28-33)。其中，三七总皂苷为其主要的药用活性成分，在三七中含量约为12%（郑丽华, 卢昌均, 周志昆. HPLC测定三七总皂苷中5种皂苷的含量及稳定性考察. 中医药临床杂志, 2012, 24(1): 73-75)。三七皂苷是治疗心血管疾病的活性成分，也是目前研究较为系统的化学物质，三七皂苷具有扩张冠状动脉、增加冠状血流量、降低血小板表面活性、抗动脉粥样硬化、抑制血小板活化、降低血黏度、黏附和聚集、抗血栓形成等作用(赵铁夫, 王盛宇, 陈宏. 不停跳冠状动脉旁路移植术术前应用三七三醇皂苷抗血小板的疗效研究. 中国医药, 2015, 10 (3): 309-311)。至今为止，已有70余种三萜类皂苷分别从三七的根茎、根块及花等组织中分离鉴定出来，它们均属于达玛烷型四环三萜类。它们具有非常广阔的应用和开发前景。三七独特的药效使得它在民间具有不可替代的地位，也是复方丹参滴丸、云南白药、血塞通、片仔癀等药品的主要原料，是我国少有的高附加值药用经济植物。

随着近年来三七产业的快速发展，三七种植面积的逐年增加，三七在大规模生产中面临的问题也随之而来，当前制约三七可持续发展的原因有两个方面：一是连作障碍问题严重，在三七的实际生产中适合种植三七的土地日益紧张，需要间隔10-15年以上才能复种，连作障碍大大增加了三七的种植成本。二是没有优良的新品种，三七种质资源严重退化，三七病害种类逐年增大，对三七的大规模生产造成巨大损失(崔秀明, 黄路琦, 等. 中国三七产业现状及发展对策. 中国中药杂志，2014, 39 (4): 553-557)。

三七的主要病害是根腐病，主要症状为根部腐烂，呈湿腐和干腐两型，地上部黄萎或青枯，常年损失5%～20%，严重的达70%，损失占各种三七病害的70%～85%；(蒋妮, 覃柳燕, 叶云峰. 三七病害研究进展. 南方农业学报, 2011, 42 (9): 1070-1074)。而轮枝镰刀菌是根腐病的致病菌之一。轮枝镰刀菌是属于镰刀属的一种真菌，菌丝呈白色长毛状，生长速度较快，2-3天即可生长成熟（兰楠. 轮枝镰刀菌velvet复合物生物学功能及粗糙脉孢菌有性发育分子调控机制的研究, [学位论文] 2013- 中国科学院大学: 微生物学）。