[发明专利]一种体外重现肠道微生物组的系统及其应用方法在审

专利信息
申请号: 201811518985.1 申请日: 2018-12-12
公开(公告)号: CN109735438A 公开(公告)日: 2019-05-10
发明(设计)人: 胡会玲;张希春;王菊霞 申请(专利权)人: 山西中医药大学
主分类号: C12M1/26 分类号: C12M1/26;C12M1/24;C12M1/12;C12M1/04;C12N1/20
代理公司: 太原晋科知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 14110 代理人: 郑晋周
地址: 030619 山西省晋中市榆*** 国省代码: 山西;14
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摘要:
搜索关键词: 厌氧 氮气导管 空气导管 模拟装置 培养装置 取样装置 注射装置 超滤膜 伸入 种体 重现 分析测试技术 胃肠道微生物 肠道微生物 连续注射器 模拟胃肠道 人体生理学 丁基胶塞 顶部设置 恒温摇床 技术要求 模拟系统 模拟小肠 采样器 丁基胶 高通量 离心管 针管式 营养学 吸收 应用
【权利要求书】:

1.一种体外条件重现胃肠道微生物组的系统,其特征在于:由取样装置、模拟装置、注射装置、培养装置,其中:取样装置为针管式采样器;模拟装置包括底部设置有超滤膜且置于离心管内的厌氧管,厌氧管顶部设置丁基胶塞,丁基胶塞上设置氮气导管和空气导管,氮气导管伸入丁基胶塞内底部,空气导管伸入至厌氧管底部; 注射装置为连续注射器;培养装置为恒温摇床。

2.根据权利要求1所述的一种体外条件重现胃肠道微生物组的系统,其特征在于:所述针管式采样器为2ml玻璃采样器;厌氧管为2ml;离心管顶部与厌氧管过盈配合;所述超滤膜为微孔滤膜,孔径为0.001um,耐酸碱度pH 1.0-2.5,温度37℃。

3.利用权利要求1所述的一种体外条件重现胃肠道微生物组的系统进行重现胃肠道微生物组的方法,其特征在于:步骤如下:

(1)样品采集:用玻璃取样器将胃液和食物营养液按照体积比为2:1的混合液1ml注入粪便中,然后用针头进行搅动,抽取混悬液,然后再注入粪便中,反复搅动、抽取、注入3次,最后抽取粪便、胃液和食物营养液混合物0.5ml;

(2)建立重现系统:用连续注射器将1ml食物营养液和胃液比为2:1的混合物注入厌氧管内,添加0.05M盐酸和0.5M碳酸氢钠,pH保持在1.0-2.5;丁基胶塞密封厌氧管,然后通入氮气3-5s,排出空气,管内达到无氧环境;用取样器将步骤(1)所提取的粪便混合物注入厌氧管内,重现系统建立;

(3)胃中微生物重现:将重现系统置于恒温摇床上,控制摇床温度为37℃,振荡频率200r/min;培养时间为2-4h,培养过程中每30min抽取菌液测定其在600nm处的吸光度值,根据测量值OD值为0.8-1时培养结束;

(4)培养完成后,抽取菌液样本,采用高通量的测序方法进行胃中微生物组的分析;

(5)小肠中微生物重现:用连续注射器向培养完成的厌氧管中加入小肠液0.5ml,加入0.5M氢氧化钠,调节pH为6.0-7.5;然后将厌氧管置于恒温摇床控制摇床温度为37℃,振荡频率200r/min;进行肠道微生物组的培养,培养时间为4-6h;培养过程中,开始培养30min,进行第一次排气,接下来培养过程中,每间隔1.5h进行一次排气,直至培养结束;每次排气完成后离心,离心速度为8000-12000r/min,离心至管内没有液体;离心完成后对管内进行食物营养液和小肠液的补充,以及添加氢氧化钠调节pH为6.0-7.5,培养4h后,每30min抽取一次菌液,测定其在600nm处的吸光度值,根据测量值,OD值为0.8-1时即为培养结束;

(6)培养完成后,抽取菌液样本,采用高通量测序技术进行微生物组的分析;

其中:胃液的制备方法为:2g NaCl、3.2g胃蛋白酶,置于100mL容量瓶中,加入36.5%浓HCl 7mL,然后添加无菌蒸馏水定容至100mL,配制好的胃液置于4℃冰箱保存;

胰液的制备方法为:0.9g胰蛋白酶、6g胆汁盐、12.5gNaHCO3,用无菌蒸馏水溶解并用1000mL容量瓶定容,配制好的胰液置于4℃冰箱保存;

食物营养液的制备方法为:月示蛋白胨(南京茂捷微生物科技有限公司)15g、胰酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨3g、酵母浸粉5g、牛肉粉2g、消化血清粉13.5g、牛肝浸粉1.2g、葡萄糖3g、磷酸氢二钾2.5g、氯化钠3g、可溶性淀粉0.3g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸钠0.15g加入1L蒸馏水中,将pH调至7.2,25℃灭菌30 min。

4.根据权利要求3所述的利用体外条件重现胃肠道微生物组的系统进行重现胃肠道微生物组的方法,其特征在于:所述模拟胃中培养2-4h;模拟小肠中培养4-6h。

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