[发明专利]一种维持和恢复毛乳头细胞干性的外泌体制剂

权利要求书

1.一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于该制剂采用以下方法制备：

1）毛乳头细胞（DPC）的分离获取，采集患者后枕部区域单位毛囊组织，采用改良二步酶消化法进行实验室DPC的分离培养；

2）外周血单个核细胞的分离，抽取肝素抗凝静脉血30mL，取6 个15mL离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液5mL，将5mL 外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2000r/min 20℃离心20min，收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS 洗涤2次备用；

3）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞筛选，MACS 分选上述步骤获得的外周血单个核细胞进行细胞计数，加PBS洗涤，1200r/min 离心后弃上清，以MACS buffer 90μL/每10⁷个细胞重悬，加入CD4+T 细胞Biotin⁃Antibody10μL/每10⁷个细胞，混匀，进行第一次孵育，第一次孵育结束后加入20μLAnti⁃Biotin MicroBeads/每10⁷个细胞，混匀，进行第二次孵育，第二次孵育结束后，以MACS buffer将细胞调整至500μL体积，过LD柱，收集过柱后流下来的细胞悬液为CD4+T 细胞（阴选），将细胞洗涤离心后，以MACS buffer 90μL/每10⁷个细胞重悬，加入CD25MicroBeads，混匀，进行第三次孵育，第三次孵育结束后，加入1-2mL MACS buffer 洗涤离心，倾去上清，重悬至500μL，过MS 柱，把separator移开，放置1mL MACSbuffer于MS 柱上，迅速将细胞打下，收集流下的为CD4+CD25+T细胞（阳选）；

4）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基的获取，将筛选获取的CD4+CD25+Treg细胞接种于细胞培养袋，培养15d后，吸取培养基于250ml离心管，800g离心10min，上清液即为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基；

5）DPC诱导培养基的配置，将步骤4）中所获取的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基与DPC培养基混合，所得培养基即为DPC诱导培养基；

6）DPC的诱导培养，待第三代DPC铺满率为70%时，换DPC培养基为DPC诱导培养基，培养48h后，更换培养基为DMEM基础培养基；

7）外泌体制剂的制备，在不含血清的DMEM基础培养基中培养48h后，收集细胞培养上清液，经超速离心法获取外泌体；用生理盐水或DMEM溶解为含DPC外泌体浓度为1*10¹⁰颗粒/ml的溶液，即得外泌体制剂。

2.如权利要求1所述的一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于步骤1）中改良二步酶消化法的步骤为：

1）经过手术后的单个毛囊置于毛囊采集液中于4℃环境保存，用含1%的双抗的PBS溶液清洗毛囊组织2～3次；

2）显微镜下用1ml注射器针头将毛球部组织整个分离出来，将残留的毛母质清除干净，用移液枪将组织移至新的含PBS溶液的培养皿中；

3）将PBS清洗一次后加入0.2%胶原酶IV，在37℃温度下消化1h～2h，间隔10min观察消化状态，同时用吸管吹打组织，待有毛乳头组织周边的真皮鞘组织全部解离出来后，在显微镜下用移液枪挑选出单个毛乳头组织，放置入一个新的培养皿中；

4）DPC的贴壁培养：将步骤1）中获得的毛乳头组织进行贴壁培养：毛乳头组织在37℃、5%CO₂培养箱中进行贴壁培养，待组织全部贴壁并有细胞爬出后更换培养基，以后每间隔3天更换一次培养基，待细胞生长融合达到80%进行消化收集获取原代DPC。

3.如权利要求2所述的一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于4）中培养基为：基础培养基+10%胎牛血清+10ng/ml EGF+10ng/mlbFGF。

4.如权利要求1所述的一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于步骤3）中第一次孵育、第二次孵育、第三次孵育的温度均为2-8℃，第一次孵育时间为5min，第二次孵育时间为10mim，第三次孵育时间为15min。

5.如权利要求1所述的一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于步骤5）中DPC诱导培养基中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基体积占比为30%－70%。