[发明专利]一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法

权利要求书

1.一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，包括：

一级种子的培养；

二级种子的培养；

高密度发酵；

诱导产酶；

酶的提取；

酶液喷雾干燥；

单细胞甲醇蛋白的获得；

其特征在于，所述诱导产酶阶段，将高密度发酵阶段的种子培养至溶氧反弹后继续饥饿培养 2-3h，进入甲醇-多元醇诱导阶段，该多元醇为季戊四醇、甘油、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇中的一种,在甲醇中按照0.5-2:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。搅拌转速不变，恒速流加含 12 mL/L PTM1 的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，1 mL/L/h-6 mL/L/h,每小时增加1 mL/L/h，控制溶氧在10%-20%。

2.根据权利要求1所述的一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，其特征在于，

一级种子培养阶段：将毕赤酵母接入至一级种子培养基上，在30℃摇床中振荡培养22-26小时，摇床转速为200-300rpm，获得一级摇瓶种子。

3.根据权利要求1所述的一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，其特征在于，

二级种子培养阶段：每升无机盐培养基中加入4mL 的微量元素溶液后，再调整pH值到5.0，将一级摇瓶种子接种到加入微量元素溶液后的无机盐培养基上，在30-32℃，pH5.0，通气量0.5-1.2v/(v×min)，搅拌转速400-650rpm，培养时间22-26h 。

4.根据权利要求1所述的一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，其特征在于，

高密度发酵阶段：

A种子液准备及接种

取-80℃甘油管保存的重组菌株，在YPD固体平板上划线，并置于 30℃恒温培养箱培养2-3 天至长出单菌落。挑取单菌落接种于含 50mL YPD液体培养基的500 mL 三角摇瓶，置于 30℃ ,220 rpm 培养24h。

高密度补料发酵在含有1200 mL BSM培养基的3-L发酵罐上执行，发酵参数如下：

温度 30℃，pH 5.5，通气量 2.0 vvm和初始转速 200 rpm。

B分批培养及甘油流加

培养 16 h 的150 mL种子液被接入发酵罐培养基中，自动添加氨水将 pH 控制在5.5。每小时转速为100 rpm至500 rpm。培养16 h后（17-27h），以指数流加方式进行 50% (v/v)甘油（含 12 mL/L PTM1）补料，调整通气量 4.0 vvm和转速 850 rpm。补料速率为前 6 h分别为 20.25、24.3、28.8、34.2、40.8 和 48.6 mL/h/L，随后4 h的补料速率为 45 mL/h/L。

5.根据权利要求1所述的一种提高毕赤酵母发酵脂肪酶酶活力及甲醇蛋白产量的制备方法，其特征在于，

诱导产酶阶段：将高密度发酵阶段的发酵液培养至溶氧反弹后继续饥饿培养 2-3h。进入甲醇-多元醇诱导阶段，在甲醇中按照1:1的体积比加入多元醇MPC,共同流加。转速不变，恒速流加含 12 mL/L PTM1 的甲醇-多元醇用于流加诱导，梯度增加甲醇-多元醇浓度，1mL/L/h-6 mL/L/h,每小时增加1 mL/L/h，控制溶氧在10%-20%。