[发明专利]一种产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种产L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶的基因工程菌及其应用，属于生物工程领域。本发明通过构建重组大肠杆菌，获得具有高酶活的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶菌株，将重组菌株摇瓶发酵，以L‑Asp‑Na作为底物，进行全细胞催化反应制备L‑丙氨酸。此法与化学生产法相比，生产工艺安全清洁，无环境污染，催化效率高，终产物L‑丙氨酸产率96％以上，简化产物的分离纯化步骤。

技术领域

本发明涉及一种产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-丙氨酸是一种具有重要价值的氨基酸，在日化、食品和医药行业中有着广泛的用途。在日化领域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性剂的原料；在食品领域，L-丙氨酸具有甜味，能与谷氨酸钠制成混合调味品，可调制并明显改善食品风味，而不破坏食品原有的风格；在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6和L-氨基丙醇(盐酸左氧氟沙星合成前体)的主要原料；同时，L-丙氨酸是复合氨基酸注射液和输液的主要成分，也是心肌功能增强剂。

在化学合成生产中，丙酸氯化法是合成L-丙氨酸的常见思路，但该方法存在产品质量差，合成路线长，收率低，成本高，环境污染严重等缺点，目前基本被淘汰。使用生物酶催化法和发酵法制备L-丙氨酸已成为工业生产上主要采用的方法。

目前用于制备L-丙氨酸的生物合成法主要有两种，一种是优化代谢途径，敲除次级代谢产物编码基因和L-丙氨酸消耗旁路基因，获得生产L-丙氨酸菌株，在培养微生物过程中合成L-丙氨酸；周丽等以野生型大肠杆菌为出发菌株，敲除代谢产物合成途径编码基因以及丙氨酸消旋酶编码基因，将L-丙氨酸脱氢酶基因转入缺陷型菌株中获得目的菌株，该菌株发酵生产L-丙氨酸在摇瓶水平产量可达67.2g/L。另一种方法使生物酶法合成L-丙氨酸，即通过表达L-天冬氨酸-β-脱羧酶，以L-天冬氨酸作为底物，脱去β-羧基生成L-丙氨酸。编码L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因Asd被发现广泛存在于假分枝杆菌、假单胞菌、粪产碱菌、醋酸杆菌、产气荚膜菌等微生物中。徐虹等人通过诱变获得一株具有L-天冬氨酸-β-脱羧酶活性的假单胞菌，对底物L-天冬氨酸催化转化率接近100％，但需要5天进行催化反应，时间过长；Wang等人在大肠杆菌异源表达Pseudomonas sp.ATCC 19121来源的Asd酶，该酶比酶活为280U/mg，比酶活很低。

因此，提供一种高产L-丙氨酸的方法、一种酶活更高的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，对于工业应用生产L-丙氨酸具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一株重组来源于不动杆菌(Acinetobacter sp.ACNIH2)的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的大肠杆菌，并以该重组大肠杆菌为催化剂，利用全细胞催化法生产L-丙氨酸。

本发明的第一个目的是提供一株大肠杆菌重组菌，异源表达了不动杆菌(Acinetobacter sp.ACNIH2)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶。

在本发明的一种实施方式中，所述Acinetobacter sp.ACNIH2来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21为宿主。

在本发明的一种实施方式中，以pET 28a(+)为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述不动杆菌来源的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供上述重组菌的构建方法，所述方法是将L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因Asd与表达载体连接，转入大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：

(1)合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因Asd；