[发明专利]一种利用重组酶聚合酶等温扩增技术快速检测淋病奈瑟菌的可视化方法

权利要求书

1.用于检测淋病奈瑟菌的引物，该引物为一套淋病奈瑟菌特征性引物组，共有两套引物组，其中一套引物组由两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物；两套引物组分别为(1)如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物组，或者(2)如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物组。

2.权利要求1所述的任一引物组在检测淋病奈瑟菌的试剂盒中的应用。

3.一种检测淋病奈瑟菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述的任一引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的任一引物组，采样管，粗提试剂Lysis buffer，反应组分，阳性对照和阴性对照，其中所述阳性对照为淋病奈瑟菌的基因组DNA，所述阴性对照为ddH₂O。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，包括样本采集管、粗提试剂Lysisbuffer、浓度为10μmol/L的正向和反向引物、RPA反应缓冲液、荧光染料EvaGreen、MgOAc、阳性对照和阴性对照。

6.一种检测淋病奈瑟菌的方法，包括以下步骤：

1)使用样本粗提试剂完成样本基因组DNA的快速提取；

2)以待测样本的基因组DNA为模板，在上述专用引物组的引导下通过PRA技术进行特异性扩增；

3)反应结束后进行结果的判读：在反应液中添加了饱和荧光染料EvaGreen，在紫外灯下，根据反应液的颜色变化判断检测结果，绿色表示反应中有特异的核酸序列，即样本中存在淋病奈瑟菌，判读为阳性；无色表示反应中无特异的核酸序列，即样本中不存在淋病奈瑟菌，判读为阴性。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1中的粗提试剂Lysis buffer是由5.0g Chelex-100和1.0ml TritonX-100溶于100ml TE缓冲液(Tris 10mM,EDTA 1mM)配制而成；所述步骤1中的待测样本包括分泌物或尿液；所述步骤1中样本基因组DNA的快速提取方法包括：向待测样品中加入粗提试剂Lysis buffer对样品进行稀释，混匀，室温放置1min，于金属浴或水浴锅中95-100℃(优选的100℃)加热10min完成样本基因组DNA的提取。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2中的RPA反应体系总体积为27μl，浓度为10μmol/L的正、反向引物各1.5μl，RPA反应缓冲液14.75μl，样本基因组DNA 2μl，荧光染料EvaGreen 2μl，MgOAc(醋酸镁)1.25μl，ddH₂O补足至27μl；

所述步骤2中的RPA扩增反应程序为：金属浴或水浴锅中37-39℃恒温，15-20min。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2中的RPA扩增反应程序为：37℃恒温反应5min后，取出，上下颠倒混匀数次，再恒温反应10min。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)收集病人分泌物或者尿液样本；

2)对于尿液样本，8,000rpm离心10min后，弃上清，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysis buffer；对于分泌物的拭子样本，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysis buffer，搅拌，将拭子浸泡在Lysis buffer中5min；

3)将样本采集管置于金属浴或水浴锅中，95℃加热10min，室温静置，完成样本基因组DNA的提取；

4)以上述步骤获得样本基因组DNA为模板，在两套引物组任何一套的引导下进行RPA扩增反应，其中27μl的反应体系包括：浓度为10μmol/L的正、反向引物各1.5μl，RPA反应缓冲液14.75μl，样本基因组DNA 2μl，荧光染料EvaGreen 2μl，MgOAc1.25μl，ddH₂O补足至27μl，每次检测反应均同时引物阳性对照和阴性对照反应管；

5)将反应管置于金属浴或水浴中，37℃恒温反应5min后，取出，上下颠倒混匀数次，再恒温反应10min；

6)反应结束后进行结果的判读，在紫外灯下，根据反应液的颜色变化判断检测结果，绿色表示反应中有特异的核酸序列，即样本中存在淋病奈瑟菌，判读为阳性；无色表示反应中无特异的核酸序列，即样本中不存在淋病奈瑟菌，判读为阴性。