[发明专利]一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于酶工程领域。本发明是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600)作为表达宿主，通过表达来源于链霉菌(Streptomyces racemochromogenes)的磷脂酶D编码基因(PLD)，得到了产磷脂酶D的枯草芽孢杆菌基因工程菌，在前期构建质粒的基础上在250mL摇瓶上通过启动子优化，成功使酶活从26.3U/mL，提高到34.7U/mL，并将发酵周期缩短到了24h。通过质粒稳定性检测，在传代5次后，质粒持有率依然达到100％，在200L罐上放大生产，酶活比摇瓶培养提高近5倍，达到171.5U/mL，可用于磷脂酶的工业化生产及转酯产物磷酯酰丝氨酸的生成。

技术领域

本发明涉及一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

磷脂酶D(PLD)属于磷脂酰二酯合成酶类，具有该家族的明显特征，即含有两个间隔出现的H(x)K(x)₄D(H代表组氨酸；K代表赖氨酸；D代表天冬氨酸；X代表任意氨基酸)保守序列。磷脂酶D可以催化底物相中的磷脂类物质和水相中的亲核供体发生类似于酯缩合的转酯反应，是合成磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等稀有磷脂的良好工具酶之一。利用该酶的高度专一性，对现有来源广泛的粗品磷脂进行转化和改性，可以制备一些稀有磷脂，在医药及食品保健品领域具有很大的应用价值。

目前，磷脂酶D主要通过从大豆等植物或动物脑中分离提取得到，生产成本高，环境污染代价大，售价昂贵，不能满足市场需求。而现有的通过微生物法构建基因工程菌来发酵生产磷脂酶D的方法，结果都不理想。在大肠杆菌、毕赤酵母、解脂耶氏酵母及链霉菌中异源表达磷脂酶D均出现过报道，但均存在一定的缺陷。如在大肠杆菌中磷脂酶D蛋白易形成包涵体，且磷脂酶D对大肠杆菌的生长有抑制作用，导致分泌量很低；酵母为真核生物，发酵周期通常较长，如张莹等以毕赤酵母为宿主时，获得的重组磷脂酶D酶活仅为1U/mL，且发酵时间长达3天(张莹.在不同宿主中表达链霉菌磷脂酶D的研究[D].华东理工大学,2013)，且在酵母中磷脂酶D的酶活和蛋白表达量均不显著，并不适用于工业化生产；链霉菌的克隆表达系统已经比较成熟，但相比于原核表达系统，外源基因的引入相对复杂，部分链霉菌还存在一定的限制修饰系统，会导致转化率过低，且链霉菌生长过程较为复杂且易发生遗传突变，成熟的表达系统数量也有限，以上瓶颈限制了链霉菌表达系统的广泛应用。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别，且具有清晰的生理和遗传背景，我们尝试以枯草芽孢杆菌为表达宿主来表达磷脂酶D。但是，链霉菌属于放线菌目的一科，枯草芽孢杆菌则属于芽孢杆菌属的一种，两者属于不同的菌种，遗传上可能存在一些隔阂，导致链霉菌来源的目的基因可能并不能被枯草所识别，在枯草芽孢杆菌中表达磷脂酶D存在一定的难点。

另外，采用枯草芽孢杆菌进行磷脂酶D的工业化生产，若能够成功获得胞外酶，可直接将发酵上清液添加到底物中进行产物磷脂酰丝氨酸(PS)的生产。但是，PS多添加在奶粉，保健品等食品中，因而对抗生素的残留有严格限制。发酵过程中为了防止质粒丢失，通常会在接种时添加一定浓度的抗生素，导致有一部分抗生素残留到产品中。因此，质粒的稳定性尤为重要。

因此，提供一种成本低、环保、可溶性表达量高且质粒稳定性高的产磷脂酶D的基因工程菌，对于工业生产磷脂酶D具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌，将如下DNA片段融合后表达：SpoVG启动子、RBS及spacer区、amyE信号肽、与来源于链霉菌(Streptomycesracemochromogenes)10-3的磷脂酶D基因；所述SpoVG启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述RBS及spacer区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述amyE信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。