[发明专利]一种生物转化生产鲨肌醇的大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一株大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法，以及利用该菌株进行的鲨肌醇的制造方法，属于生物技术领域，其特征在于包括稳定的重组表达质粒及重组表达质粒构建大肠埃希氏菌工程菌株pSI3的方法和利用得到的所述的重组大肠埃希氏菌工程菌株pSI3催化肌醇生产鲨肌醇的方法，本发明的有益效果是:利用该工程菌株的静息细胞法催化肌醇生产鲨肌醇，由于肌醇转运蛋白的存在，底物肌醇的浓度在反应温度下可得到最大化，可以充分利用细胞进行鲨肌醇的转化生产，利用该工程菌株进行发酵培养，处理后菌体可以收集进行静息细胞反应，发酵液粗处理后既可以用于鲨肌醇的分离提取，也可以重复用于菌株的发酵培养。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，更具体地涉及利用分子生物学方法和微生物学方法制备一株大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法，以及利用该菌株进行的鲨肌醇的制造方法。

背景技术：

鲨肌醇是一种环己烷的多元羟基衍生物，在一些植物和哺乳动物中存在，分布广，但含量少。它具有与肌醇相似的化学和生理性质，并且还被发现具有一些特殊的生物活性。

鲨肌醇可以透过人体的血脑屏障，降解人脑内积聚的β-淀粉样蛋白斑块，而β-淀粉样蛋白的沉积是人体脑内老年斑周边神经元变性和死亡的主要原因。因此鲨肌醇对治疗阿尔茨海默病、唐氏综合症和Angelman综合症等脑部疾病具有一定效果。

鲨肌醇的获得主要有三种方法：提取法、化学转化法和生物合成法。提取法和化学方法操作较为复杂，并且有污染，不够安全环保；而生物合成法由于反应条件温和，能耗低，环境友好，正在被广泛研究和应用。

目前国内尚无鲨肌醇的生产和研制报告。国外则主要为日本和欧美的研究报告，包括生理代谢过程、生产方法和在医药上的应用等。其中：

专利号为EP1674578B1和CN1867676A的发明，阐述了利用筛选获得的醋杆菌属的菌株，进行突变育种后，可以将肌醇通过鲨肌糖转化为鲨肌醇，并对相关反应的酶进行了研究。通过向反应液中加入硼酸和金属盐形成复合物，再将其溶于酸中并从其中分离得到鲨肌醇产品。该方法整个流程操作复杂，并且反应液中副产物较多；对鲨肌醇的分离方法中包括浓盐酸的使用和硼酸的清除既不安全也难保证产品质量要求，并且鲨肌醇的产率的损耗也较大。因此存在应用局限性。

专利号为EP2357222A1和CN102203238A的发明，公开了一株可以将肌醇转化为鲨肌醇的枯草芽孢杆菌，通过对该菌内部酶系的研究，对其进行了基因改造，得到的变异菌株通过发酵可以直接得到鲨肌醇。但是发酵液中可能会有副产物D-手性肌醇，同时鲨肌醇的转化效率也较低，最高转化率仅为16%。

专利号为EP2811029A1、CN104245950A和TWI506137B的发明，通过基因工程方法，构建了含有肌醇-1-磷酸合酶基因、肌醇-单磷酸酶基因、肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因的工程菌株，通过发酵培养可以直接将葡萄糖和其相似物等转化为鲨肌醇。其在底物利用情况上有一定的进步性，但在生产上也存在一定的局限性。培养基成分较复杂，一次发酵时间较长，发酵液中存在副产物葡萄糖-鲨肌醇衍生物，最终鲨肌醇的产率仅为12.4g/L。这可能与参与反应的酶系较多，反应难以最大化协调作用有关。

发明内容：

本发明提供了一株生物转化生产鲨肌醇的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3、一种生物转化生产鲨肌醇的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株pSI3的构建方法及应用该菌株进行生物转化鲨肌醇的方法。

解决的第一个技术问题是：化学方法合成鲨肌醇使用高温条件和强酸，产生了污染环境的大量的含有盐类物质酸性废水的问题；

解决的第二个技术问题是：离体酶稳定性差，持续反应受限的问题；