[发明专利]一种培养Steinernema feltiae线虫的方法

说明书

本发明公开了一种培养Steinernema feltiae线虫的方法。将S.feltiae感染期幼虫接种到人工卵液中，感染期幼虫恢复生长成成虫，成虫怀卵，卵孵化成一龄幼虫、再生长经过二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫，然后再生长得到第二代成虫。S.feltiae在人工卵液和柞蚕蛹血淋巴中恢复及发育较快，2d可以观察到成虫怀卵，3d可观察到小虫孵育，6‑7d可以观察到第2代成虫怀卵，在柞蚕蛹血淋巴水混合液中发育稍慢，4d才出小虫，7d尚未观察到第2代成虫怀卵。由此可见，本发明的培养S.feltiae线虫的方法不但可以使S.feltiae线虫完成世代交替，相比于柞蚕蛹血淋巴，其能够更快更高效的恢复感染期幼虫，并且其生长速度更快，这为线虫的快速高效培养提供了条件。

技术领域

本发明属于昆虫病原线虫培养领域，具体涉及一种培养S.feltiae线虫的方法。

背景技术

昆虫病原斯氏属Steinernema和异小杆属Heterorhabditis线虫是国际上新型的高效生物杀虫剂(Georgis et al.，2006)，从二十世纪30年代开始就被用于害虫的防治(Smart，1995)，具有杀虫能力强，杀虫谱广，能主动搜索寄主，对人畜、环境安全等优点，易于大量培养及配制产品，并能与多种化学农药混用，对钻蛀及地下害虫有特效(Kaya andGaugler 1993；Grewal et al.，2005；Georgis et al.，2006；Yan et al.，2013；颜珣等，2014)。

昆虫病原线虫的生活史起始于感染期幼虫(Infectivejuveniles，IJ)携带共生细菌进入寄主昆虫体内，感染期幼虫避开昆虫的免疫反应，在昆虫血淋巴内释放共生细菌(Dowds and Peters，2002)。共生细菌在昆虫血淋巴内增殖，杀死寄主昆虫，线虫取食共生细菌以繁殖。当昆虫体内营养耗尽，3龄耐受态感染期幼虫形成，在外界环境足够湿润且温度适宜时，感染期幼虫携带共生细菌离开寄主昆虫(Brown and Gaugler，1997)，搜寻新的寄主。感染期幼虫是昆虫病原线虫生活史中唯一能自由存活的龄期，可使用普通的喷雾器进行施用以防治害虫。感染期幼虫能存活1到多个月，可进行产业化培养(Wright et al.，2005)。

昆虫病原线虫的产业化培养是昆虫病原线虫推广及商业化应用的基础。昆虫病原线虫可以通过寄主昆虫进行体内培养，亦可以在体外通过固体培养基或用发酵罐进行液体培养。昆虫病原线虫的体外培养需要共生细菌的参与，共生细菌可将培养基中的营养物质转化成昆虫病原线虫生长发育繁殖所需的成分(Dowds and Peters，2002)。进行昆虫病原线虫的产业化培养时，液体培养是最合算的，但是固体培养和体内培养同样重要，固体培养在劳动力便宜的国家和地区更为适用，因为所需要的前期投入少；体内培养则适合于实验室内种质保存及小量实验。

发明内容

本发明的目的是提供一种更加快速高效恢复，更快生长的培养S.feltiae线虫的方法。

本发明的培养S.feltiae线虫的方法，包括以下步骤：

将S.feltiae感染期幼虫接种到人工卵液中，感染期幼虫恢复生长成成虫，成虫怀卵，卵孵化成一龄幼虫、再生长经过二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫，然后再生长得到第二代成虫；

所述的人工卵液含有柞蚕蛹血淋巴、海藻糖、鸡蛋黄、脱脂奶粉、N’s盐溶液和水。

第二代的成虫可以继续培养，如此循环往复，完成世代交替。

优选，所述的人工卵液每9ml是通过以下制备方法制备的：将柞蚕蛹血淋巴3ml，无水海藻糖0.1g，鸡蛋黄2.5ml，脱脂奶粉0.1g，N’s盐溶液1ml和无菌水2.5ml混合均匀，所述的N’s盐溶液是每升含有NaCl 7.5g，KCl 0.1g，CaCl₂0.2g，NaHCO₃0.2g，余量为水。