[发明专利]洗涤缓冲液及采用该洗涤缓冲液提纯牛血红蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种洗涤缓冲液，其中，该洗涤缓冲液由HEPES和巯基化合物组成，所述缓冲液中HEPES摩尔浓度为19‑21mM，巯基化合物摩尔浓度为3‑6mM，所述洗涤缓冲液的pH值为7.5‑7.8。本发明还公开了采用该洗涤缓冲液提纯牛血红蛋白的方法。本发明的洗涤缓冲液，配制方便，用于阴离子交换层析提纯牛血红蛋白，能够得到高纯度的牛血红蛋白，纯度可达99％以上；本发明的提纯牛血红蛋白的方法，能够简化阴离子交换层析过程，纯化方法简单，采用本发明的洗涤缓冲液冲洗层析柱，能够得到高纯度的牛血红蛋白，并且收率可以达到90％以上，可直接作为后期化学交联聚合的原料，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种洗涤缓冲液，特别的本发明还涉及一种采用该洗涤缓冲液提纯牛血红蛋白的方法。

背景技术

通过化学方法交联血红蛋白，由于其具有保存期长、粒径更小(纳米级)、血型通用等特点，可用作血液替代品，在野外创伤失血救护，外科手术器官保护，脑卒中抢救等领域有广泛用途。由于血液代用品临床用量较大，如果残留微量杂蛋白或者杂质参与到后期化学交联反应中就可能引发病人强烈的免疫反应，只有超高纯度的血红蛋白的原料才能保证交联后的血红蛋白用于临床用途。目前血红蛋白主要从牛羊猪等动物血红细胞中分离纯化获得，分离纯化血红蛋白常用的步骤包括沉淀法、离心法、切向流过滤法和层析法等，沉淀法、离心法、超滤法由于分辨率的限制只能用于前期的粗提，如去除细胞碎片大颗粒不溶物核酸等，不能有效去除微量血浆杂质，如血浆中残留白蛋白免疫球蛋白，或者分子量与血红蛋白接近的杂质，如碳酸酐酶分子量与血红蛋白二聚体接近，只有最后层析法由于其拥有高分辨率的特点，通常用于获得高纯度血红蛋白的最后一步纯化。

目前文献报道的用于血红蛋白分离的层析技术包括离子交换层析，亲和层析等。其中，离子交换层析法具有填料成本低、易于放大、清洗再生成本低等特点，得到更广泛的应用，其中US5264555公开了一种阴离子交换流穿模式法纯化牛血红蛋白，虽然简单快速，但是其分辨率不高，一些相关杂质如碳酸酐酶等红细胞内相关杂质可能会随血红蛋白一起流穿，纯度难于达到临床级原料要求，Guoyong Sun,Andre F.Palmer报道了一种用氯化钠梯度洗脱的阴离子交换方法(Preparation of ultrapure bovine and human hemoglobinby anion exchange chromatography Journal of Chromatography B,867(2008)1–7)，由于梯度洗脱对层析柱柱效，上样量都有严格的要求，同时需要对层析系统有梯度洗脱功能，这样增加了生产成本，另外洗脱时间也比较长，增加了蛋白柱上氧化形成高铁血红蛋白和变性的风险，同时洗脱溶液消耗量大增加了废液处理量，另外最终收获的血红蛋白中含有氯化钠，后期化学交联时需要进一步做透析换液处理，增加了工艺步骤，不适合后期商业化大规模生产，因此有必要开发一种简单实用的缓冲液体系，用于商业化阴离子交换层析纯化牛血红蛋白。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种洗涤缓冲液，用于阴离子交换层析提纯牛血红蛋白，能够得到高纯度牛血红蛋白，纯化方法简单，得到的牛血红蛋白纯度高，可达99％以上。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种洗涤缓冲液，其中，该洗涤缓冲液由HEPES和巯基化合物组成，所述缓冲液中HEPES摩尔浓度为19-21mM，巯基化合物摩尔浓度为3-6mM，所述洗涤缓冲液的pH值为7.5-7.8。其中，HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

上述洗涤缓冲液，其中，所述巯基化合物选自2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、2-巯基乙胺·盐酸、D,L-半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、γ-谷氨酰基-半胱氨酸、2,3-二巯基-1-丙醇、巯基乙酸酯或盐、1,4-丁二硫醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、通式硫醇-[CHO]n-硫醇中的一种或两种以上。

上述洗涤缓冲液，其中，所述洗涤缓冲液中HEPES摩尔浓度为20mM，巯基化合物摩尔浓度为5mM。