[发明专利]一种应用CRISPR/Cas9介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法

权利要求书

1.一种应用CRISPR/Cas9系统基因打靶的方法，其特征在于基于CRISPR/Cas9系统，选择具有DNA单链切割能力的Cas9的突变体，针对每个打靶位点使用一条tracrRNA/crRNA二元复合体或者一条sgRNA，Cas9的突变体识别打靶位点附近的保守的间隔相邻基序，产生DNA单链切口，而不产生DNA双链断裂，诱导单链切口同源重组修复。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述基因打靶包括基因敲除、基因敲入。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述Cas9的突变体选自Cas9n D10A和/或H840A。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于针对每个靶基因设计至少2个打靶位点，每个打靶位点的间隔不小于100bp。

5.一种应用CRISPR/Cas9系统制备基因打靶ES细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)根据基因打靶的类型和靶基因选择合适的打靶位点，设计同源DNA供体和鉴定方案；

(2)采用权利要求1-4任一项所述的方法，制备Cas9的突变体或其表达载体，根据靶基因和打靶位点设计并制备sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体或各自的表达载体；

或者，制备Cas9的突变体、sgRNA或者crRNA和tracrRNA的共表达载体；

(3)将步骤(1)制备得到的Cas9的突变体、sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体，或者各自的表达载体或共表达载体转染入ES细胞，根据基因打靶的类型选择同时转染同源DNA模板使打靶位点发生碱基删除或将外源DNA插入到基因组；

(4)提取ES细胞DNA进行PCR鉴定和/或Southern Blot检测与核型鉴定，鉴定通过的克隆即为基因打靶阳性ES细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤(2)还包括进一步检测制得的sgRNA或者crRNA和tracrRNA二元复合体的切割效率。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述检测包括核酸内切酶检测法、SSA报告载体检测法、Sanger测序法、Digenome-Seq技术。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述核酸内切酶选自SURVEYOR酶、T7EN1酶。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于将野生型Cas9蛋白、sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体，或者各自的表达载体或共表达载体转染ES细胞，提取细胞基因组并用特异引物扩增目标切割区域，对获得的PCR产物进行T7EN1酶切，酶切后进行电泳检测，检测结果显示比对照组多出一条或多条条带的视为有效切割，或者对获得的PCR产物进行Sanger测序，测序结果比对显示，sgRNA区域出现双峰视为有效切割；筛选出高效sgRNA或crRNA和tracrRNA。

10.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其特征在于所述转染ES细胞的方法包括病毒转染、脂质体转染、电转染。

11.一种应用CRISPR/Cas9介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法，其特征在于采用权利要求5-10任一项所述的方法制备得到基因打靶阳性ES细胞注射到动物囊胚中，将囊胚分别移植到代孕母体中，进行饲养，生产出的后代即为F0代嵌合体动物，F0代性成熟后与同背景野生型动物配繁获得F1代，通过基因鉴定的阳性F1代动物即为基因打靶动物模型。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于基因打靶动物模型为哺乳动物。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于基因打靶动物模型选自小鼠或大鼠。