[发明专利]一种烟叶中玉米素核苷液液萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法

说明书

一种烟叶中玉米素核苷液液萃取－液相色谱－串联质谱的测定方法，包括以下步骤：以甲醇：水：甲酸溶液(80：19.9：0.1，V/V/V)作为浸提液，烟叶样品经低温浸提后，浸提液加入乙酸乙酯低温超声萃取，萃取液低温离心后，取上层有机相清液，低温氮吹近干，甲醇复溶后经有机滤膜过滤，采用液相色谱－串联质谱联用法测定烟叶中的玉米素核苷，内标法定量。本发明的特点是：采用同位素稀释内标法定量避免了分析过程中基质效应的影响；本方法前处理简单，可快速、准确检测烟叶中玉米素核苷的含量，且重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。

技术领域

本发明属于理化检验技术领域，具体涉及烟叶中玉米素核苷含量的测定方法。

背景技术

玉米素核苷是细胞分裂素在木质部中运输的重要形式，细胞分裂素是一类氮杂环的碱性小分子，主要功能是促进烟叶细胞的分裂和扩大，有研究表明细胞分裂素可以通过促进物质的积累和蛋白质与核酸的合成来阻止烟叶的衰老，细胞分裂素在烟草植物体内广泛分布。目前有关烟草内源植物细胞分裂素的检测方法主要有免疫分析法和色谱分析。其中免疫分析法有较低的检出限的优势，但需解决制备的抗体的交叉反应问题；目前色谱法运用最为广泛，虽然气相色谱-质谱、高效液相色谱等分析方法已经能够对植物组织或细胞提取液中的植物激素进行定量分析，但对于少量甚至微量植物样品中植物激素的同时检测还存在困难。主要原因，一是玉米素核苷激素的含量极低，通常都在ng/g数量级，如此低的含量要求其检测方法和仪器对植物激素具有超高的灵敏度；二是玉米素核苷激素不稳定、对温度和介质环境比较敏感；三是烟草植物体系基质十分复杂，直接检测会受到大量基质干扰物的影响。因此对样品处理方法的选择性和除杂能力有很高的要求，同时要求定量分析方法和仪器对目标植物激素有超高的灵敏度。但近年来，随着色谱与质谱联用技术快速发展，串联质谱(MS/MS)中母离子和子离子一一对应的多重反应监测模式可以有效去除因复杂基质干扰而引起的假阳性，相对于单级质谱法和高效液相色谱法，LC-MS/MS法是一种灵敏度更高，选择性更好、特异性更强的方法，在分析速度、灵敏度、选择性方面具有很好的优势。因此，通过对烟草这一复杂样品体系进行适当的前处理，对植物激素的选择性检测能力有极大提高，能够实现准确定性。

烟叶中玉米素核苷的液液萃取-液相色谱-串联质谱分析方法未见公开报道，准确测定其含量，能为更好地了解烟草主要内源植物激素的生理功能和代谢途径，为烟草种植提供技术支持，提高基地烟叶产量和品质。

发明内容

本发明弥补了现有分析技术的不足，提供一种烟叶中玉米素核苷液液萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法。

本发明的技术方案是提供一种烟叶中玉米素核苷液液萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法，包括以下步骤：

(1)提取液的制备：使用甲醇、水和甲酸，配制甲醇:水:甲酸溶液(80:19.9:0.1,V/V/V)作为提取液。

(2)内标储备液配制：用甲醇配制氘代玉米素核苷(d2-ZR)内标储备液，浓度为1000ng/mL。

(3)标准储备液配制：用甲醇配制玉米素核苷(ZR)标准储备液，浓度为100μg/mL。

(4)样品前处理及分析：新鲜烟叶样品在液氮下研磨后储存于-50℃冰箱中备用。取处理后的新鲜烟叶样品于2mL离心管中,加入内标储备液(1000ng/mL)及提取液(甲醇:水:甲酸溶液＝80:19.9:0.1,V/V/V)，低温浸提，后加入萃取剂低温超声萃取，萃取液经过离心后，移取上层清液约900μL，氮吹浓缩至近干，用甲醇复溶，复溶液过有机膜后，样品试液进行LC-MS/MS测定。

(5)标准曲线绘制：用的空白样品液稀释标准储备液配成系列浓度的工作标准溶液，制作标准曲线。工作标准溶液配置的系列浓度为1、5、10、20、50、100、200ng/m L，得7级工作标准溶液；ZR及d2-ZR采用正离子模式，对上述系列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，求得玉米素核苷的标准曲线。