[发明专利]耐热磷酸化酶及其应用

说明书

本发明涉及耐热磷酸化酶及其用途。该耐热磷酸化酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该耐热磷酸化酶可以有效用于甘油葡糖苷的催化合成，酶活力高，制备甘油葡糖苷时酶用量较小，生产成本较低，且甘油葡糖苷的产量较高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及耐热磷酸化酶及其应用，更具体地，本发明涉及耐热蔗糖磷酸化酶、分离的核酸、构建体、微生物、全细胞催化剂以及甘油葡糖苷的制备方法。

背景技术

甘油葡糖苷是一种由甘油分子与葡萄糖分子以糖苷键结合的物质。它是一种天然细胞激活剂，常用作化妆品原料，具有以下功能：能保护细胞膜和细胞结构不变性、不受损伤；具有优异的锁水能力，在极度干燥的环境中细胞中依然有水存；分子量小，易吸收。目前制备甘油葡糖苷的方法主要包括化学合成和酶催化合成法。

2000年，日本Takenaka F.等鉴定了日本清酒中3种不同构型的甘油葡糖苷，并通过化学合成的方法实现这3种物质的化学合成(Biosci Biotechnol Biochem,2000,64:378-385)。然而，化学合成方法具有高污染、高能耗、制备工艺复杂等缺点。

专利WO2008034158公开了一种利用蔗糖磷酸化酶(SPase)催化蔗糖和甘油转化为甘油葡糖苷的酶催化合成方法，在0.3M蔗糖、2.0M甘油、20U/mL酶、pH 7.0、7.5h反应条件下，甘油葡糖苷产物浓度约0.29M，即产量约73g/L。然而，该酶催化合成方法成本高、产量较低，难以在工业生产中广泛应用。

因此，甘油葡糖苷的制备方法还需进一步深入研究。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

发明人对专利WO2008034158进行深入研究后发现，首先，该专利中所用的SPase酶为商业化酶制剂或纯的酶，商业化酶制剂价格十分昂贵，生产成本较高，而纯的酶需要经过复杂的分离纯化工艺方可得到，生产工艺过于复杂。其次，SPase酶活力不高，制备甘油葡糖苷时酶的用量较大，增大了生产成本。另外，该专利生产甘油葡糖苷时产量较低。综合上述几种因素，该专利方法生产成本较高，产量较低，难以在工业生产中广泛应用。

基于上述问题，发明人经过大量的实验探索，构建了耐热重组蔗糖磷酸化酶(TSPase)的大肠杆菌工程菌株，并将其发酵所得的菌体作为生物催化剂进行甘油葡糖苷的制备。该制备方法直接采用含TSPase酶的菌体细胞作为生物催化剂，避免了购买昂贵的商业用酶制剂或者进行复杂的菌体破壁、浓缩处理，生产成本更低，制备工艺更加简便，且甘油葡糖苷的产量更高。另外，TSPase酶的活力高，制备甘油葡糖苷时催化剂用量较少，降低了生产成本。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种耐热磷酸化酶。根据本发明的实施例，所述耐热磷酸化酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。根据本发明实施例的耐热磷酸化酶可以有效用于甘油葡糖苷的催化合成，酶活力高，制备甘油葡糖苷时用量较小，生产成本较低，且甘油葡糖苷的产量较高。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述分离的核酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。过表达根据本发明实施例的核酸可以获得前面所述的耐热磷酸化酶，进而有效用于甘油葡糖苷的催化合成，且生产成本低，产量高。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体携带上述分离的核酸。根据本发明实施例的构建体转染受体细胞后获得的微生物可以有效表达前面所述的耐热磷酸化酶，进而用于甘油葡糖苷的催化合成，且生产成本低，产量高。在一些实施例中，所述构建体的载体为pET-28A，由此，所述构建体的转染效果好。