[发明专利]一种产β-胡萝卜素的重组菌及利用Crispr-Cas9技术构建的方法

权利要求书

1.一种利用Crispr-Cas9技术构建产β-胡萝卜素的重组菌的方法，其特征在于：在解脂亚罗酵母中敲除ku70基因，然后将来源于三孢布拉霉的β-胡萝卜素合成通路关键基因carRA、carB和解脂亚罗酵母内源基因GGS1、tHMG以snf为靶点整合至敲除ku70基因的解脂亚罗酵母基因组中，再利用Crispr-Cas9技术调控carRA、carB、GGS1、tHMG的拷贝数，构建成产β-胡萝卜素的重组菌。

2.根据权利要求1所述的构建产β-胡萝卜素的重组菌的方法，其特征在于：所述在解脂亚罗酵母中敲除ku70基因的方法为：

以解脂亚罗酵母Po1f的基因为模板，利用引物ku70-up-F和ku70-up-R，用保真酶pfuPCR扩增ku70的上游同源臂，利用引物ku70-down-F和ku70-down-R，用保真酶pfu PCR扩增ku70的下游同源臂；将ku70的上游同源臂插入到质粒pLoxp-ura3-pLoxp的ApaI和XbaI双酶切位点，将ku70的下游同源臂插入到质粒pLoxp-ura3-pLoxp的SpeI和NdeI双酶切位点，获得质粒pLoxp-ura3-pLoxp-△ku70，将该质粒用酵母转化试剂盒转入解脂亚罗酵母Po1f基因组中，得到敲除ku70基因的解脂亚罗酵母，即菌株Po1f(△ku70)；

上述各引物序列如下：

ku70-up-F：ACCGTGGGCCCCATAGGCCCATAAAGTACG

ku70-up-R：CAGCTTCTAGATTTCAAAAAGCGGCGGT

ku70-down-F：ACTGAACTAGTCTAGGGAGGCACATCTAA

ku70-down-R：CTGACCATATGTATCATGGCTGAAGTTGAG

上述质粒pLoxp-ura3-pLoxp是敲除载体，其主要元件有AmpR、两个loxp位点以及位于两个loxp位点之间的ura3筛选标记。

3.根据权利要求2所述的构建产β-胡萝卜素的重组菌的方法，其特征在于：所述将来源于三孢布拉霉的β-胡萝卜素合成通路关键基因carRA、carB和解脂亚罗酵母内源基因GGS1、tHMG以snf为靶点整合至敲除ku70基因的解脂亚罗酵母基因组中的方法为：

以解脂亚罗酵母Po1f的基因为模板，利用引物snf-up-F和snf-up-R，用保真酶pfu PCR扩增snf的上游同源臂，利用引物snf-down-F和snf-down-R，用保真酶pfu PCR扩增snf的下游同源臂；将snf的上游同源臂插入到质粒pLoxp-ura3-pLoxp的ApaI和XbaI双酶切位点，将snf的下游同源臂插入到质粒pLoxp-ura3-pLoxp的SpeI和NdeI双酶切位点，获得质粒pLoxp-ura3-pLoxp-△snf；将质粒opt pJN44-carRA/carB/GGS1/tHMG用XbaI和SpeI双酶切后的片段carRA/carB/GGS1/tHMG插入质粒pLoxp-ura3-pLoxp-△snf的SpeI酶切位点，得到质粒ura3-△snf-carRA/carB/GGS1/tHMG；用酵母转化试剂盒将质粒ura3-△snf-carRA/carB/GGS1/tHMG整合至菌株Po1f(△ku70)的基因组中，得到基础菌株Y.L 1.1；

上述各引物序列如下：

snf-up-F：ACTGCGGGCCCGACGCAAAAGGAAGAAACAGA

snf-up-R：GTACTTCTAGAGGAGTGGTATGTAGTCGTG

snf-down-F：CTGACACTAGTAAACACTCCTTGGTGAACT

snf-down-R：CATGACATATGGGAATTCGTGCAGAAGAAC。