[发明专利]一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法

说明书

本发明提供一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，包括以下步骤：(1)将藻蓝蛋白β亚基编码基因与载体连接，得到重组质粒，所述重组质粒含有启动子；(2)制备酵母感受态细胞，将重组质粒经电转化法转入酵母感受态细胞，培养得到酵母转化子，筛选阳性酵母转化子；(3)阳性酵母转化子转接入发酵培养基中培养。本发明成功实现在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基，发酵结束后，藻蓝蛋白含量达到60.8～167.6mg/L，占总蛋白的40.5～61.3％。本发明方法不仅藻蓝蛋白得率较高，操作简单，原料易得，成本低，而且本发明在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基，为进一步研究藻蓝蛋白的β亚基功能提供了大量的基础材料。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法。

背景技术

藻蓝蛋白(Phycocyanin,简称PC，吸收光谱在610～640nm)是重要的捕光色素蛋白，不仅可以作为工业原料和食品添加剂。而且由于藻蓝蛋白易于与生物素、抗体等蛋白质结合，因此藻蓝蛋白作为荧光探针越来越受到重视。目前藻蓝蛋白主要从螺旋藻中分离纯化制得，但螺旋藻养殖困难，破壁困难，从螺旋藻中分离纯化藻蓝蛋白成本高、工艺复杂、得率低，而且原料浪费严重。酵母表达系统是迄今为止最为成功的高效表达系统，其细胞繁殖速度快，生长周期短，破壁容易，遗传背景相对清楚，外源基因可稳定遗传，表达产量高，成本低，特别适合用于蛋白表达。因此借助基因工程与发酵工程技术生产藻蓝蛋白将成为本领域新趋势。

此外，藻蓝蛋白主要由α和β亚基组成，α和β亚基先通过二硫键形成(αβ)单体，再通过共价键形成(αβ)₃三聚体或(αβ)₆六聚体，至于组成PC的α和β亚基在行使生物学功能时，哪一个亚基更重要或是否需要特定的空间结构，国内外均未见报道。

发明内容

鉴以此，本发明的目的是提供一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，不仅解决现有技术中生产藻蓝蛋白时成本高、得率低等问题，而且本发明在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基，为进一步研究藻蓝蛋白的β亚基功能提供了大量的基础材料。

本发明的技术方案是：

一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，包括以下步骤：

(1)将藻蓝蛋白β亚基编码基因与载体连接，得到重组质粒，所述重组质粒含有启动子；

(2)制备酵母感受态细胞，将重组质粒经电转化法转入酵母感受态细胞，培养得到酵母转化子，筛选阳性酵母转化子；

(3)阳性酵母转化子转接入发酵培养基中培养。

优选的，所述藻蓝蛋白源于极大螺旋藻。

优选的，所述酵母为酿酒酵母。

优选的，所述启动子为GAL1或GAL10。

优选的，所述载体为pYES2。

优选的，步骤(2)中采用YNB培养基进行培养，所述YNB培养基包括以下成分：葡萄糖30～40g/L、硫酸铵0.6～0.9g/L、YNB 15～20g/L、亮氨酸20～30μg/L和色氨酸25～35μg/L，pH 5.0～5.5；培养的条件为：25～28℃、280～300r/min震荡培养15～20h。

优选的，所述发酵培养基包括以下成分：酵母粉20～25g/L、胰蛋白胨10～12g/L、葡萄糖20～25g/L、半乳糖2～5g/L、K₂HPO₄ 0.1～0.3g/L和亮氨酸5～20μg/L，pH 5.5～6.0。

优选的，步骤(3)为：阳性酵母转化子转接入发酵培养基中，30～38℃、500～800r/min发酵培养36～48h，收集菌体，即得。

优选的，在发酵过程中，保持发酵罐中DO值始终维持25～30％。