[发明专利]一种提高松二糖产量的淀粉蔗糖酶突变体

说明书

本发明公开了一种提高松二糖产量的淀粉蔗糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。该淀粉蔗糖酶突变体D447V是通过将来源于Deinococcus Geothermalis的淀粉蔗糖酶第447位天冬氨酸突变为缬氨酸得到的。将淀粉蔗糖酶突变体D447V应用于松二糖的生产，在pH 7.0、35℃的反应条件下，松二糖的产量为57.01g/L，是野生酶产量的1.8倍。因此，本发明的淀粉蔗糖酶突变体能够应用于松二糖的制备中，提高松二糖的转化率。

技术领域

本发明涉及一种提高松二糖产量的淀粉蔗糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

松二糖是一种天然存在于蜂蜜中的还原性二糖，由一分子葡萄糖和一分子果糖以α-1,3糖苷键连接形成，是蔗糖的同分异构体，甜度为蔗糖的一半。松二糖具有容易结晶、高度可溶、水解速率慢，不会被致龋微生物发酵等特点，适合肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用。在食品工业中具有广阔的应用前景，具有代替蔗糖成为新型功能性甜味剂的潜力。此外，松二糖还可以广泛应用于医药、化妆品等领域，是一种高附加值的产品。

关于利用酶制备松二糖的方法，目前仅有两种报道。一种方法是以α-环糊精和果糖的混合物为底物，利用环糊精葡萄糖基转移酶合成松二糖。另一种方法是以蔗糖为底物，利用淀粉蔗糖酶直接将蔗糖异构化为松二糖。与环糊精葡萄糖基转移酶利用α-环糊精与果糖为底物且需糖化酶处理来制备松二糖相比，淀粉蔗糖酶仅需蔗糖底物，成本较低、工艺简洁，转化率更高。

淀粉蔗糖酶属于α-淀粉酶家族(GH13)，以蔗糖为天然底物，水解作用较弱，主要催化聚合和异构这两大转苷反应，而这两大转苷反应的发生依赖于蔗糖浓度。当蔗糖浓度较高时淀粉蔗糖酶以异构反应为主，主要产物为松二糖；当蔗糖浓度较低时淀粉蔗糖酶则以聚合反应为主，生成大量不溶性的α-1,4糖苷链及可溶性的麦芽低聚糖。因此，在松二糖的制备过程中，尽管淀粉蔗糖酶催化聚合反应在一定程度上会被高浓度的蔗糖所抑制，但反应至一定程度时蔗糖浓度会减少，聚合反应的发生还是会影响松二糖的最终产率。因此，获得一种聚合活性减弱的淀粉蔗糖酶突变体对于提高松二糖的转化率具有重要的工业应用潜力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种催化异构化反应能力提升的淀粉蔗糖酶的突变体。

本发明提供了一种淀粉蔗糖酶突变体，将来源于Deinococcus Geothermalis的淀粉蔗糖酶第447位氨基酸进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于Deinococcus Geothermalis的淀粉蔗糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ IDNO.1的淀粉蔗糖酶第447位氨基酸由天冬氨酸(Asp)突变为缬氨酸(Val)得到的，命名为D447V。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备淀粉蔗糖酶突变体的方法，包括如下步骤：

(1)在淀粉蔗糖酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带淀粉蔗糖酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，制备酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶的出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶的来源为中度嗜热菌(DeinococcusGeothermalis)。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。