[发明专利]一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种高产5‑甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为表达宿主，通过过量表达5,10‑亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF，二氢叶酸还原酶编码基因dfrA，二氢叶酸合成酶编码基因folC、敲除双功能同型半胱氨酸S‑甲基转移酶/5,10‑亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU，得到了积累5‑甲基四氢叶酸枯草芽孢杆菌基因工程菌，5‑甲基四氢叶酸产量达到952.05ug/L，换算细胞干重，产量为342.40ug/g DCW。

技术领域

本发明涉及一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

L-5-甲基四氢叶酸(5-MeTHF)是叶酸在人体内发挥作用的唯一 活性形式，是叶酸类药物中唯一能透过血脑屏障的药物。5-MeTHF能预防新生儿神经管缺陷，并具有防治阿尔茨海默病的作用。此外，由于5-MeTHF对正常细胞有较高的选择性保护作用，临床上逐步代替抗肿瘤药甲氨蝶呤的解毒剂5-甲酰四氢叶酸。5-MeTHF也被用于巨幼红细胞性贫血、风湿性关节炎等疾病的治疗。欧盟于2005年底批准5-MeTHF系列产品为安全的食品增补剂，更促进了市场对5-MeTHF的需求。目前，国内5-MeTHF的研究主要集中在化学合成方面，合成方法涉及不对称中心的拆分，此过程中5-MeTHF易失活，收率不理想。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别，Bacillus subtilis 168 中存在合成5-甲基四氢叶酸的内源途径，因此运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级5-甲基四氢叶酸的有效途径。

然而，枯草芽孢杆菌生产5-甲基四氢叶酸存在诸多问题，例如，5-甲基四氢叶酸的合成与分解代谢同时进行，并且前提物质叶酸的产量也很低，导致野生型菌株5-甲基四氢叶酸产量极低。

发明内容

为解决上述科学问题，本发明通过增加前体物质供应，并且阻断5-甲基四氢叶酸的分解代谢途径，以提高5-甲基四氢叶酸的产量。

本发明的第一个目的是构建一种积累5-甲基四氢叶酸的重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌敲除了甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌过表达二氢叶酸还原酶编码基因 dfrA。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌过表达了二氢叶酸合成酶编码基因 folC。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，并过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF。

在本发明的一种实施方式中，敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，敲除了甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU，并过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF。