[发明专利]牛PLIN2互作蛋白双分子荧光互补载体的构建方法

说明书

本发明涉及一种牛PLIN2互作蛋白双分子荧光互补载体的构建方法，以牛PLIN2的CDs区全长氨基酸序列，通过设计PLIN2在双分子荧光互补VN‑173载体上的引物，与pBiFC‑VN173载体重组来构建目的蛋白表达载体，酶切位点选择EcoRI和XbaI酶切，反应温度为37℃，并在EcoRI位点后增加一个碱基A，防止移码突变，最终得到牛PLIN2互作蛋白双分子荧光互补载体pBiFC‑VN173‑PLIN2。与现有研究蛋白互作方法相比，可以更高效表达并避免假阴性结果的存在。同时，也为进一步研究及构建蛋白互作网络及提高蛋白互作理论的完整性提供一定的试验验证手段。

技术领域

本发明属于分子生物学、细胞工程技术领域，涉及一种脂肪细胞分化相关蛋白互作蛋白的筛选，具体地说，是一种牛PLIN2互作蛋白双分子荧光互补载体的构建方法。

背景技术

脂滴(lipid droplets)是由囊泡结构包裹着的中性脂的储存场所，广泛存在于机体所有器官中，它与很多细胞功能有关，如能量代谢平衡、对脂毒性的自我保护、信号转导等。脂滴外周膜的结构主要为单层磷脂分子层，具有特殊的蛋白锚定结构，中性脂(主要为ATGL、胆固醇酯)构成疏水核心。目前已知的围脂滴蛋白(perilipin)、脂肪细胞分化相关蛋白(adipophilin)、尾巴相互作用蛋白(TIP47)三者组成PAT家族锚定在脂滴表面，与脂滴结构组成及代谢有关。

PAT蛋白家族在不同物种中广泛存在，除在脂肪细胞中出现外，还在其他类型细胞(如肌细胞，上皮细胞等)脂滴积累过程中出现。研究表明，围脂滴蛋白有5种类型，分别被命名为PLIN1～PLIN5。PLIN2最初发现于脂肪及类固醇生成的细胞中，是一种脂肪细胞因子，主要在脂肪细胞分化的早期表达，对促进细胞内脂滴的形成起着重要作用，也被称为脂肪分化相关蛋白(adipocytes differentiation-related protein，ADRP)，其可以通过疏水作用与中性脂滴核心连接而结合脂滴、聚集磷脂，使每个脂滴周围形成单分子层。另外，在排卵前期鼠的卵母细胞中，PLIN2表达量会出现上调趋势，这可能与PLIN2参加能量代谢有关。

Prokesch等研究发现，在鼠乳腺上皮细胞转脂肪细胞分化试验中，在表皮生长因子5(ELF5)刺激下乳腺上皮细胞中PLIN2表达量增高，且可检测到脂肪细胞的标志蛋白，因此，PLIN2也可作为一个研究其他细胞是否成功转脂分化的标志蛋白。在体外试验中，有研究提出PLIN2是脂肪细胞分化时出现的第一个蛋白，可作为前体脂肪细胞分化为脂肪细胞过程中的标志基因。因此，PLIN2对脂肪细胞分化过程具有重要的生理意义。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种牛PLIN2互作蛋白双分子荧光互补载体的构建方法，得到的该载体寻找与其发挥功能的互作蛋白种类，为研究某些特定生物学现象提供理论依据。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种牛PLIN2互作蛋白双分子荧光互补载体的构建方法，其特征在于，该方法以牛PLIN2的CDs区全长氨基酸序列，通过设计PLIN2在双分子荧光互补VN-173载体上的引物，与pBiFC-VN173载体重组来构建目的蛋白表达载体，酶切位点选择EcoRI和XbaI酶切，反应温度为37℃，并在EcoRI位点后增加一个碱基A，防止移码突变，最终得到牛PLIN2互作蛋白双分子荧光互补载体pBiFC-VN173-PLIN2。

根据本发明，所述的牛PLIN2的CDs区全长氨基酸序列为：