[发明专利]一种基于适配体与滚环扩增的外泌体检测方法

说明书

本发明涉及一种基于适配体与滚环扩增的外泌体检测方法，应用电化学传感器的方法构建出基于外泌体特异性的适配体探针，利用G‑四联体‑Hemin模拟过氧化酶催化H₂O₂反应产生信号，并结合滚环扩增合成大量G‑四联体进行信号放大，实现外泌体的定量检测，并用于实际血清样本的检测。本发明应用电化学传感器的方法构建出基于外泌体特异性的适配体探针，利用G‑四联体‑Hemin模拟过氧化酶催化过氧化氢产生信号，并结合滚环扩增合成大量G‑四联体进行信号放大，极大的提高了外泌体的检测灵敏度。

技术领域

本发明涉及生化检测和分子诊断领域，具体涉及一种基于适配体与滚环扩增的外泌体检测方法。

背景技术

外泌体为各类细胞分泌的双层膜性囊泡，直径在30-100nm，其中含有细胞特异的蛋白质、脂质和核酸等多种组分。外泌体几乎在所有类型的人体体液，包括外周血，唾液，尿液，等中均可有效检测。外泌体所携带和传递重要的信号分子形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关，如肿瘤细胞分泌的外泌体可进入淋巴系统和肿瘤组织内的毛细血管，发挥对恶性肿瘤的调控作用。此外，外泌体的特征部分也能反映来源肿瘤的表型，其携带的肿瘤特异性抗原和miRNA可以作为肿瘤诊断标志物。调查研究显示，外泌体通过参与转移前微环境的形成，调控细胞的增殖和凋亡等，在癌症的侵袭和转移中发挥着重要作用。除了用于疾病诊断外，外泌体还具有抗肿瘤免疫，诱导肿瘤免疫逃逸、促进肿瘤血管新生和肿瘤转移等生理功能。因此，体液中的外泌体不仅可以作为癌症早期诊断及预后评价的重要指标。

众所周知的，DNA是贮存和传递遗传信息的分子，由于其精确的A-T，C-G碱基互补配对原则赋予了其结构的可预测性和重复性，近年来，DNA也被用于构建从一维到三维的各种球状、树枝状以及更为复杂的纳米结构。DNA纳米结构具有生物相容性好、易于化学修饰、物理化学性质稳定等优点，因此在临床医学领域有着巨大的潜力。电化学生物传感器的特异性好、灵敏度高，且成本较低，近年来，有相关基于外泌体表面标志物的三明治免疫夹心法、多通道金芯片等电化学法检测外泌体的报道，研究者通过不同的信号放大原理实现了对外泌体的定量检测，且能够用于实际血清样本的检测，然而，这些方法都存在各自的缺陷，比如灵敏度较低，无法针对特异性的癌症相关外泌体等，因此，筛选出能特异性结合癌症相关外泌体的靶向探针，并设计高效的信号放大机制，最终构建出高灵敏度的外泌体电化学传感器对于辅助癌症的早期诊断和治疗有着重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于适配体与滚环扩增的外泌体检测方法。本发明解决了由于正常细胞产生的外泌体对检测产生干扰，背景信号高，利用外泌体特异性抗体或适配体作为识别探针的方法则存在灵敏度低的问题。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种基于适配体与滚环扩增的外泌体检测方法，包括如下步骤：

1)制备修饰外泌体膜蛋白抗体的金电极，利用BSA封闭位点；

2)通过磷酸化的挂锁探针和连接探针制备环状模板，利用核酸外切酶去除未成环的探针；

3)将抗体修饰的电极与外泌体孵育，将外泌体特异性适配体-引物探针修饰到电极表面；

4)加入环状模板、聚合酶缓冲液、dNTPs、BSA及phi29DNA聚合酶，将电极在37℃孵育，再与高铁血红素溶液孵育；

5)用PBS洗涤，将电极浸入到工作溶液进行电化学测量，电极工作溶液的成分为：PBS+100mM KCl+8mM H₂O₂。

步骤1)所述制备修饰外泌体膜蛋白抗体的金电极是通过先在预处理电极上形成半胱胺自组装单层，再与戊二醛溶液反应，抗体经由半胱胺的自组装单层和戊二醛的双官能交联固定到金电极的表面。