[发明专利]一种精准调控谷氨酸棒杆菌基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种精准调控谷氨酸棒杆菌基因表达的方法，属于合成生物技术领域。本发明标准化的最简启动子与RBS文库，使针对目标基因表达量的调控的改造工作大幅缩短，省去了内源启动子或RBS的筛选和强度表征环节，平均一个目标基因的改造周期可以由之前的30‑40天缩短为10天以内。所述调控方法的强度跨度较单一元件高一百倍以上，由此可实现对代谢途径的大幅度调控及生物系统的功能优化。较以往的粗线条的上调或下调基因表达量的方法，本发明中的利用标准元件组合调控的方法可以更加精准、定量的调控目的基因。使代谢途径得到进行更加精准的调控，尤其是分支点处的流量调节，可提高目标产物产量，同时防止某些基因过度表达给细胞带来的代谢负担。

技术领域

本发明涉及一种精准调控谷氨酸棒杆菌基因表达的方法，属于合成生物技术领域。

背景技术

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)在生物界中广泛分布的革兰氏阳性菌，广泛应用于发酵生产人类所需要的氨基酸，如谷氨酸、精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸等。

目前代谢工程改造为以大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌为代表的重要的工业微生物菌种的提高生产性状的主要手段，即应用基因工程的技术对目标微生物进行遗传改造，定向改造其代谢系统，改变代谢流量的分布，构建新的代谢途径，使代谢流向理想的方向流通，强化目的产物的合成，减少副产物的积累，使得改造后的微生物具有更强的产物合成效率，底物转化效率等。但是，对遗传改造通常造成对微生物代谢行为的过度干扰，如，简单粗放的增加，减少或删除某一条代谢途径导致微生物代谢流量未能按照预期设计分配，不仅减少目的产物的积累量，甚至不利于细胞的正常生长，极大的影响微生物生长及生产性能。因此，需要通过合成生物学的策略，精准调节代谢途径中的关键基因的表达调控元件，对流量进行精准的分配，系统地平衡菌体的自身代谢与合成产物之间的关系，实现高效的产物的积累。

基因表达调控元件是构成代谢通路的基本元素，因此基因表达调控元件的特性和功能直接影响到代谢流量的精确分布，目的产物的高效积累。基因表达调控元件包括复制起始位点、启动子、核糖体结合位点(RBS)、基因间序列、终止子、功能蛋白等等。在谷氨酸棒杆菌的基因表达调控中，最重要的调控元件为启动子和RBS，这两个元件分别调控基因表达中的转录和翻译步骤，决定基因的转录以及核糖体起始翻译的强弱。

启动子是位于结构基因5'端上游，RNA聚合酶能够特异性识别并结合的一段DNA序列。启动子与转录因子结合，激活RNA聚合酶，并在其催化下启动转录。RBS是位于mRNA的起始密码子AUG上游约8-13核苷酸处的一段由4-9个嘌呤核苷酸组成的序列，rRNA能够准确地识别出这段序列并与之结合启动翻译过程。

目前，改造启动子进而调控基因表达水平的手段已有许多报道，但是采用的具体方法效率低，需要首先筛选内源型启动子文库，再从中挑选强度适宜的启动子，替换目的基因前本来的启动子序列，实现目标基因表达量上调或下调的目的。此外也有个别通过改造RBS从而实现基因表达调控的研究，但是存在启动子一样的问题，即标准化元减少，需要首先进行筛选。究其原因在于启动子和RBS的标准化、元件化程度低，因此无法建立标准文库。同时，基因表达受到不同的调控元件的协同调节，多个元件的多重调节下，才导致了基因表达的总体水平，因此仅仅改造单一元件很多情况下效果不佳。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的启动子和RBS标准化程度低、单一调控效果差的问题，本发明提供了一种标准化的启动子与RBS联用以精准调控基因表达的方法，显著拓展了基因表达的调控强度，并且免去了筛选的环节，大大缩小的改造周期。本发明还提供了启动子与RBS联用在谷氨酸棒杆菌中的具体应用。

本发明的第一个目的是提供一种精准调控谷氨酸棒杆菌基因表达的方法，包括如下步骤：

(1)将启动子、RBS和目的基因插入到表达载体中，构建启动子与RBS联用重组表达载体；