[发明专利]一种重组人脑利钠肽包涵体高效率复性方法

说明书

本发明提供了一种重组人脑利钠肽包涵体蛋白复性方法，它包括如下步骤：(1)洗涤包涵体：取重组人脑利钠肽的原核表达包涵体，加入含2mol/L尿素的缓冲液洗涤；(2)溶解包涵体：加入溶解缓冲液，搅拌4小时，离心，得上清液；(3)在步骤(2)所得上清液中加入复性缓冲液，4℃下复性，离心，获得上清液，即可。本发明还提供了一种重组人脑利钠肽的制备方法。本发明提供的复性方法，可以有效提高重组人脑利钠肽复性效率，操作简单、成本低，应用前景良好。

技术领域

本发明属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种重组人脑利钠肽包涵体蛋白的高效率复性方法。

背景技术

脑利钠肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)，又名脑钠素，是日本学者Sodoh等在1988年首次发现的一种利钠尿肽家族激素，主要由心脏分泌，具有利钠、利尿、舒张血管和降低血压等生理功能，在维持细胞渗透压、机体水盐代谢平衡和血压稳定等方面发挥重要作用，具有良好的药用开发价值。

由于天然来源受到极大限制及内源性含量低，采用基因工程技术几乎成为了开发BN P的唯一的有效手段。目前已有重组人脑利钠肽(rhBNP)药物上市，分别为Nesiritide和新活素，用于治疗心力衰竭等病症。

大肠杆菌系统表达重组蛋白具有易于操作、遗传背景清楚和表达水平高等特点，但是发明人在新活素研发过程中发现，使用大肠杆菌表达rhBNP时，表达产物为不溶解、无活性的固体颗粒，即包涵体，需要对包涵体进行复性才能获得有活性的可溶蛋白。包涵体复性作为一个复杂的过程，其成功与否很大程度上与蛋白本身的性质有关，而rhBNP复性效率极低，不到10％，导致生产高成本。因此，开发有效的rhBNP包涵体复性方法，对大规模原核表达rhBNP是极其必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对重组人脑利钠肽包涵体蛋白的高效率复性方法。

本发明提供了一种重组人脑利钠肽包涵体蛋白复性方法，它包括如下步骤：

(1)洗涤包涵体：取重组人脑利钠肽的原核表达包涵体，加入含2mol/L尿素的缓冲液洗涤；

(2)溶解包涵体：加入溶解缓冲液，搅拌4小时，离心，得上清液；

其中，所述溶解缓冲液包括如下配比的组分：Tris-HCl 50mmol/L，氯化钠150mmol/L，8mol/L尿素，pH8.0；

(3)在步骤(2)所得上清液中加入复性缓冲液，4℃下复性，离心，获得上清液，即可；

其中，所述复性缓冲液包括如下配比的组分：

Tris-HCl 50mmol/L，氯化钠150mmol/L，L-精氨酸0.3～1mol/L，还原型谷胱甘肽1.5～2.5mmol/L，氧化型谷胱甘肽0.1～0.5mmol/L，pH8.0。

L-精氨酸：缩写L-Arg；还原型谷胱甘肽：缩写GSH；氧化型谷胱甘肽：缩写GSSG。

本发明所述的各种溶液，溶剂均为水。

本发明溶液中的各种组分浓度均为终浓度，例如“含2mol/L尿素的缓冲液”，即尿素终浓度为2mol/L。

其中，步骤(1)中，在包涵体洗涤前，先加入溶液重悬、离心；

所述重悬溶液包括如下配比的组分：Tris-HCl 50mmol/L，氯化钠150mmol/L，pH8.0。

其中，步骤(1)中，所述缓冲液包括如下配比的组分：Tris-HCl 50mmol/L，氯化钠150mmol/L，2mol/L尿素，pH8.0；

所述洗涤的方法为：加入缓冲液后重悬、离心取沉淀，即得。