[发明专利]一种动物克隆胚胎培养液及培养方法

说明书

本发明公开了一种动物克隆胚胎培养液及培养方法：按照50～100μM将牛磺熊去氧胆酸添加到胚胎基础培养液中，得到胚胎培养液；将通过核移植获得的动物克隆胚胎移入所述胚胎培养液中进行培养。本发明利用牛磺熊去氧胆酸在核移植后的培养阶段显著的抑制动物克隆胚胎的内质网应激，同时，显著的提高动物克隆胚胎的体外发育率。本发明对提高动物克隆胚胎的体外培养效率，特别是对于获得基因修饰兔和克隆兔，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及体外胚胎培养，具体涉及动物克隆胚胎培养液及培养方法。

背景技术

核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中并得到重构胚胎的细胞工程技术。该技术在构建基因修饰动物、拯救濒临灭绝物种、干细胞治疗以及线粒体治疗等领域中具有重要的价值。目前体细胞核移植效率处于极低的水平。

核移植获得的重构胚胎不同于受精胚胎，在构建胚胎的过程中涉及到显微操作过程(去核、注核、融合和激活)，核移植操作的刺激能够导致诱导细胞发生内质网应激。体外培养条件的刺激也会导致诱导细胞发生内质网应激，持续的内质网应激不利于核移植获得的重构胚胎的发育，往往导致胚胎发育阻滞和早期胚胎死亡。

当细胞受到外界的某些刺激时，内质网会产生一系列调节机制，形成内质网应激，失调的内质网应激会导致凋亡通路的激活，并导致核移植胚胎基因表达异常，从而使得核移植胚胎表现出发育阻滞和早期胚胎死亡的现象。胚胎发育率以及胚胎囊胚期总细胞数、细胞凋亡水平是主要的用于评价胚胎发育质量的指标。

在进行体细胞核移植时，去核、融合、激活等操作以及胚胎培养都会造成动物克隆胚胎发生内质网应激和氧化应激，目前并没有专门针对动物克隆胚胎的体外培养液，特别是在基因编辑兔以及体细胞核移植兔的克隆胚胎培养中，亟待提出能够抑制克隆胚胎发生的内质网应激，以及提高动物克隆胚胎发育率的培养液及培养方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种动物克隆胚胎培养液及培养方法，可以提高动物克隆胚胎的体外培养效率。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种动物克隆胚胎培养液，该胚胎培养液包括胚胎基础培养液以及内质网应激抑制剂，所述内质网应激抑制剂为具有内质网应激抑制作用的胆汁酸或其衍生物，所述胚胎培养液中内质网应激抑制剂的浓度为50～100μM。

优选的，所述胚胎基础培养液包括用于模拟动物(例如，兔子)输卵管液的理化特征的无机盐组分、有机盐组分、氨基酸组分、葡萄糖及血清白蛋白(例如，牛血清白蛋白)。

优选的，所述胚胎基础培养液所含无机盐组分具体包括1.780～1.790mM的CaCl₂·2H₂O、1.510～1.520mM的MgSO₄·7H₂O、7.160～7.170mM的KCl、1.190～1.200mM的KH₂PO₄、25.000～25.010mM的NaHCO₃以及107.590～107.690mM的NaCl。

优选的，所述胚胎基础培养液所含有机盐组分具体包括0.393～0.403mM的丙酮酸钠、4.053～4.063mM的乳酸钠以及0.340～0.350mM的柠檬酸钠。