[发明专利]一种用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法

权利要求书

1.一种用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法，其特征在于具体的标记方法如下：

(1)构建pET-22b-SNAP-Annexin V基因融合质粒载体；

(2)通过原核表达并纯化pET-22b-SNAP-Annexin V融合蛋白；

(3)用荧光小分子标记融合蛋白并纯化。

2.根据权利要求1所述用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法，其特征在于pET-22b-SNAP-Annexin V融合基因质粒载体构建方法如下：

(1)引物设计：设计Annexin V目的片段的上下游引物并引入Nhe1酶切位点，在酶切位点上游引入保护碱基，引物如下：

上游引物5’TACTAGCTAGCATGGCACAGG TTCTCAGAGG 3’；

下游引物5’ACTAGCTAGCGTCATCTTCT CCACAGAGCA G 3’；

(2)PCR扩增Annexin V目的基因

PCR反应体系30-50μL：PCR buffer(10×)3-5μL；dNTP(10×)3-5μL；pCMV-Annexin V0.5-2μL；上下游引物(20nM)各0.5-1μL；pfu DNA聚合酶0.3-0.5μL；补灭菌双蒸水至总体积为30-50μL；

PCR反应条件如下：95℃ 30sec；[95℃ 30sec；55-58℃ 1min；68-72℃ 1-5min；]16-25个循环；68-72℃ 3min；4℃保温；

PCR结束后用PCR纯化试剂盒纯化目的片段，然后用NheI酶切使酶切位点暴露，跑0.8％的琼脂糖核酸电泳并切胶回收得到Annexin V目的基因片段；

(3)酶切pET-22b-SNAPf质粒载体

酶切体系30-50μL：Buffer M(10×)3-5μL；pET-22b-SNAPf质粒5-15μL；Nhe I 1.5-3μL；补灭菌双蒸水至总体积30-50μL；37℃下酶切过夜。随后跑0.8％的琼脂糖核酸电泳，切胶回收大片段；

(4)连接Annexin V和pET-22b-SNAPf片段得到融合质粒载体

连接体系10-20μL：上述切胶回收的Annexin V与pET-22b-SNAPf摩尔比为6-10:1；连接buffer(10×)1-2μL；T4连接酶0.5-1μL；补灭菌双蒸水至总体积10-20μL；4℃连接4-8小时后取5-10μL连接产物转至E.coli DH5感受态中，挑取单斑测序确定连接结果，得到pET-22b-SNAP-Annexin V融合质粒载体。

3.根据权利要求1所述用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法，其特征在于原核表达并纯化pET-22b-SNAP-Annexin V融合蛋白过程如下：

将构建好的质粒转入E.coli BL21感受态细胞，铺平板37℃培养过夜，挑取单斑于10-30mL含50-100μg/mL Amp的LB培养基中，37℃培养过夜；

第二天将菌液转接至含有50-100μg/mL Amp的30-2000mL LB培养基中直到OD₆₀₀≈0.1，37℃震荡培养，实时监测OD₆₀₀变化，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5-1mM，28-37℃培养3-5h后收集菌体，8000-12000rpm离心5-10分钟，弃掉上清液；

菌体用pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液重悬，离心洗涤两次；将收集的菌体用20mM pH＝7.4的PBS缓冲液10-30mL重悬，加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度0.1mM；

在冰浴中超声破碎该菌液(400W，10min)，随后用高速离心机12000-14000rpm离心10-30min，收集上清液；之后用Ni NTA亲和柱纯化，用100-500mM的咪唑盐洗脱，最后用葡聚糖凝胶柱G-75进一步纯化，得到纯的目的蛋白。