[发明专利]一种用于免疫治疗的腺病毒载体

说明书

本发明公开了一种用于免疫治疗的腺病毒载体，涉及基因工程技术领域，是将干扰片段序列通过基因工程技术，包装到Ad5复制缺陷型腺病毒中，构建重组腺病毒干扰载体Ad‑siDHCR24，所述Ad5复制的缺陷型腺病毒是AD293细胞，通过腺病毒外壳纤维的改造。该用于免疫治疗的腺病毒载体，在哺乳动物中产生HPV蛋白并且诱导针对HPV的免疫应答，通过在腺病毒载体中添加外源重组基因、向导标记以及酶切识别位点，从而改变了腺病毒载体的天然嗜性，使得腺病毒载体的导向更具针对性，避免腺病毒载体感染其他正常组织，使得腺病毒载体所展现的整体的毒副作用更小，从而使得腺病毒载体在免疫治疗中有着更好的效果。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种用于免疫治疗的腺病毒载体。

背景技术

腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，在自然界分布广泛，至少存在100种以上的血清型。其基因组长约36kb，两端各有一个反向末端重复区(ITR)，ITR内侧为病毒包装信号。基因组上分布着4个早期转录元(E1、E2、E3、E4)承担调节功能，以及一个晚期转录元负责结构蛋白的编码。早期基因E2产物是晚期基因表达的反式因子和复制必须因子，早期基因E1A、E1B产物还为E2等早期基因表达所必须。因此，E1区的缺失可造成病毒在复制阶段的流产。E3为复制非必须区，其缺失则可以大大地扩大插入容量。腺病毒载体大多以5型(Ad5)、2型(Ad2)为基础，新增了55型(Ad55)，很多研究机构在研究当中，55型将比5型流行以及应用更具广泛性。

腺病毒载体具有较高的感染效率，一直在基因治疗中扮演重要角色，是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广的病毒载体之，然而腺病毒载体介导基因转导仍面临很多问题，由于腺病毒的宿主范围较广，在感染靶组织的同时也感染其他正常组织，体内应用时存在明显的组织细胞非特异性分布，特别是易在肝脏内聚集，产生毒副作用，从而导致腺病毒载体不能将目的基因有针对性的有效的导入目的细胞(例如肿瘤细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、外周血细胞、造血干细胞以及树突状细胞等)，所以迫切需要改变腺病毒载体的天然嗜性，构建针对特定组织和细胞的靶向性腺病毒载体。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于免疫治疗的腺病毒载体，解决了目前由于腺病毒的宿主范围较广，从而导致腺病毒载体不能将目的基因有针对性的有效的导入目的细胞的问题。

(二)技术方案

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种用于免疫治疗的腺病毒载体，是将干扰片段序列通过基因工程技术，包装到Ad5复制缺陷型腺病毒中，构建重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24，所述Ad5复制的缺陷型腺病毒是AD293细胞，通过腺病毒外壳纤维的改造，将经过改造的病毒骨架质粒和携带不同外源基因的穿梭质粒共转染AD293细胞，即可包装出携带不同外源基因的靶向性腺病毒。

所述腺病毒载体包括编码HPV分化体B Env蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体、编码HPV分化体C Env蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体，其中B Env蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体独立地是血清型26、血清型28和或血清型35，由此在哺乳动物中产生HPV蛋白并且诱导针对HPV的免疫应答，将B Env蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体中的阳性克隆菌分别在含Amp和Cm的抗性培养基中生长，且在含Amp和Cm抗性培养基中不能生长的克隆菌即为目的阳性克隆菌E。

所述阳性克隆菌E中E1、E3基因被敲除之后，所述阳性克隆菌E基因组中的E4基因开放阅读框6，由E4基因开放的阅读框6为AD293细胞包装出靶向性腺病毒做向导标记，所述AD293细胞中含有插入PAD-EFa-GFP腺病毒载体多克隆位点的EP153R基因，所述腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24中还含有与启动子有效连接的CTLA4Ig重组基因。