[发明专利]T细胞冻存液及其制备方法

说明书

本发明属于细胞生物学领域，更具体涉及生物冻存技术领域，尤其涉及活性免疫细胞的冻存液及其制备方法。本发明的冻存液含有二甲基亚砜(DMSO)、右旋糖苷40、人血清白蛋白(HSA)、氯化钙、氯化钾、乳酸钠。本发明的冻存液对细胞毒性小，不影响细胞原本的功能，能为细胞的冷冻、储存和解冻过程提供安全的保护。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，更具体涉及生物冻存技术领域，尤其涉及活性免疫细胞的冻存液及制备方法。

背景技术

肿瘤免疫治疗是指直接或间接利用人体免疫系统对肿瘤患者进行有效治疗的方法，主要包括肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂、细胞免疫治疗以及细胞因子类等。备受关注的细胞免疫治疗已从早期的LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)、TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)、 CIK(多种细胞因子诱导的杀伤细胞)及CTL(细胞毒性T淋巴细胞)等传统或非特异性细胞疗法，发展到特异性的CAR-T(嵌合抗原受体修饰的T细胞)和TCR-T(T细胞受体嵌合型T细胞)等细胞疗法。随着细胞治疗在临床上的广泛应用，细胞制品保存和低温运输面临巨大的挑战。

在常温或37℃环境中，细胞内生化反应活跃，代谢旺盛，这些生理过程产生大量的氧自由基和脂质过氧化物会引起环境pH值和渗透压变化，造成细胞溶胀和死亡。在细胞运输中，这一问题更为突出。在冷冻状态下，细胞几乎停止生命活动和新陈代谢，因此通常将细胞冷冻后用液氮或干冰进行转运。细胞冷冻和解冻时，容易受到溶液损伤和冰晶损伤，引发细胞死亡。

细胞冻存技术是细胞制品保存的重要手段。大量的临床试验表明人体免疫细胞功能受到肿瘤等众多疾病、衰老、环境污染、应激压力等因素的影响，直接决定了临床治疗的效果。在迫不得已情况下使用配型的异体细胞，免疫排斥风险也很大。细胞制剂区别于小分子化学药物、蛋白质药物，具有制备流程长、生产成本高、不同批次间质量控制困难等特点，成为细胞治疗大踏步前进道路上不得不攻克的瓶颈之一。为确保细胞制剂的质量控制和临床治疗，细胞制剂从细胞来源到扩增培养的终产品都离不开深低温细胞冻存技术。

1972年，Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说，即冰晶损伤和溶液损伤假说。

这个假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。同时随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。

现阶段冷冻保护剂总体上分为两种——渗透性和非渗透性，可以理解成细胞膜内冷冻保护剂和细胞外冷冻保护剂。两者对组织或细胞冷冻保护的共同之处在于均可以相对提高冻存液电解质浓度，相对降低电解质浓度的剧变，并减少由此带来的细胞损伤。渗透性冷冻保护剂主要为DMSO、丙三醇(G)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、乙酰胺、甲醇等小分子类物质；非渗透性冷冻保护剂则是聚乙烯吡咯烷酮—PVP、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等大分子类物质。以二甲基亚砜为例在同一过程中解释冷冻保护剂的保护作用：同是从室温开始往-80℃降温，不同的是此时的细胞已经浸泡在 10％DMSO的培养液中，零度以上没有问题，在零度往下的时候，水分子趋于迅速形成氢键，但是DMSO是强力氢键破坏剂，水分子只能缓缓结晶且由于DMSO的干扰锋锐不再。同时电解质浓度开始相对升高，但是考虑到电解质浓度本身就已经很高(10％的 DMSO)，因而前后环境的变化尚在细胞的承受范围之内——细胞成功保存。