[发明专利]一种菊花内生真菌的分离提纯方法

说明书

本发明公开了一种菊花内生真菌的分离提纯方法，包括以下步骤：将准备好的菊花原材料均匀分成两份，得到叶和花的原材料一和根和茎的原材料二；将所述原材料一去除边缘，裁剪成组织块，无菌水冲洗后，即得待分离内生真菌的叶花样品，将其存放无菌袋中于4℃保存；将所述菊花叶花样品以有效氯含量为10‑15％的次氯酸钠水溶液浸泡3‑4min，无菌水洗涤3‑5次，再以体积百分比为70‑75％的酒精水溶液浸泡1‑1.5min，无菌水洗涤3‑5次进行消毒；将消毒后的叶花样品边缘部分去除，得到待分离菊花样品；将所述待分离菊花样品平放于PDA基板中，将PDA基板放置在23±2℃的恒温培养箱中培养，制得培养基。有益效果：能够有效分离菊花内生真菌。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体来说，涉及一种菊花内生真菌的分离提纯方法。

背景技术

菊花是一种重要的要用植物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、舒血管、降血脂、抗肿瘤、驱铅等多种药理作用。随着国内外医药加工业的迅猛发展，药用菊花用量急剧增加。而近年来，在菊花种植的主产区已经出现菊花生长势下降，致其抗病性若，产量急剧下降的现象，无法满足市场需求。研究发现，植物为内生菌提供光合产物和矿物质。

中国发明专利CN103122331A公开的一种植物内生菌的分离方法，采用组织研磨方法进行培养，但在实际操作中，对植物组研磨处理往往采取的是经验值，并未充分考虑到不同植物或植物的不同组织，在不同的生育期因其结构或生理特性的不同而造成的处理效果特异性，造成不合适的机械外力操作导致菌株细胞损伤或使得内生真菌不能充分释放出来，因而，常常导致所分离获取的植物内生菌种类和数量降低。另外，含菌液涂布培养过程中，若浓度过高而出现真菌生长相互干扰的问题；若浓度过低而出现消耗大量培养基，增加人力和物力成本。

针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

发明内容

针对相关技术中的问题，本发明提出一种菊花内生真菌的分离提纯方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。

为此，本发明采用的具体技术方案如下：

一种菊花内生真菌的分离提纯方法，包括以下步骤：

选用健康的菊花植物进行采集，采集部位包括根、茎、叶和花；所述根和茎的长度为5cm以上，所述叶和花的面积为1.5cm以上×1cm以上；

将准备好的菊花原材料均匀分成两份，得到叶和花的原材料一和根和茎的原材料二；

将所述原材料一去除边缘，裁剪成组织块，无菌水冲洗后，即得待分离内生真菌的叶花样品，将其存放无菌袋中于4℃保存；

将所述菊花叶花样品以有效氯含量为10-15％的次氯酸钠水溶液浸泡3-4min，无菌水洗涤3-5次，再以体积百分比为70-75％的酒精水溶液浸泡1-1.5min，无菌水洗涤3-5次进行消毒；

将消毒后的叶花样品边缘部分去除，得到待分离菊花样品；

将所述待分离菊花样品平放于PDA基板中，将PDA基板放置在23±2℃的恒温培养箱中培养，制得培养基一；

待所述培养基一的组织边缘长菌后进行内生真菌分离纯化操作，制得菌落培养基；

将所述原材料二剪取嫩茎，并用清水冲洗晾干后，用无菌水对原材料二清洗2～4次，将样品边缘部分去除，内部或中心部分切分成1cm×1cm大小的组织块，得到株茎样品；

将所述株茎样品在25℃黑暗条件下放入三角瓶中培养3-6天后，制得培养基二，并将所述培养基二置于预先准备好的恒温培养箱中培养；

将所述菌落培养基采用预先准备好的打孔器制得菌片，同时将所述菌片放置在所述培养基二中进行培养，并设置平行组和对照组；