[发明专利]一种用于熊猫乳汁miRNA检测的内参基因及其应用

说明书

本发明涉及一种用于熊猫乳汁miRNA检测的内参基因及其应用，属于生物技术领域。本发明用于熊猫乳汁miRNA实时定量PCR检测的内参为miR‑128‑2‑3和miR‑200a‑3p。本发明公开了检测该内参的引物。该内参与引物可用于制备熊猫乳汁miRNA内参检测试剂盒。本发明的内参miR‑128‑2‑3和miR‑200a‑3p在不同个体，不同时间点之间的表达最为稳定，且表达丰度高，适合乳汁检测应用的miRNA定量参考标准。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于熊猫乳汁miRNA检测的内参基因及其应用。

背景技术

自miRNA发现以来，以成为生命科学领域的研究重点。miRNA是一类长度20-25nt的内源性非编码RNA(noncoding RNAs)，是由具有发卡结构，长度约为70到90nt的前体miRNA加工而来。miRNA能够与靶mRNA的3’末端UTR区部分或完全结合，从而导致翻译的抑制或靶mRNA的降解。目前的研究发现miRNA的功能包括调控细胞生长、细胞增殖、细胞凋亡和众多生理和病理进程中扮演着重要的调控作用，这种小分子不但在细胞内起到重要作用，也在血清、血浆、唾液、尿液等各种体液中执行特定功能。乳汁是哺乳动物新生儿最重要的营养和被动免疫来源，富含多种免疫成分，能够满足婴幼儿大脑发育、生长以及健康免疫系统的各种需求。

大熊猫已在地球上生存了至少800万年，被誉为“活化石”，据研究表明，大熊猫初乳分泌时间长达30～40天，且初乳中富含受miRNA调控的免疫相关蛋白，并通过哺乳过程对新生个体发育发挥重要作用。然而，同一miRNA表达特征在不同的研究中差异很大，一旦体液中的特定miRNAs表达特征被广泛接受，那么这种检测miRNA的方法就提供了一种非入侵或是低入侵式生长或免疫相关生物标记的检测方式。并且熊猫乳汁检测的标准一旦建立，即如同生化学检测那样具备普遍性、强制性和客观性的特点，会在最大限度上排除主观因素的干扰，进而提高诊断效率。但是，miRNA的表达特征在不同的研究中有较大差异，不仅表现在组织之间有差异性，而且在不同泌乳阶段上也有差异。

鉴定miRNA的方法通常会用到定量PCR法(q-PCR)，采用q-PCR技术对miRNA进行定量的方法主要有两种，第一种称为poly(A)加尾法，即先通过poly(A)聚合酶(PAP)处理总RNA，使得miRNA的3’端加上一段poly(A)尾巴然后使用5’端含有接头序列的poly(T)引物进行反转录，产生了有一段接头的Cdna,为后面PCR扩增提供反向通用引物，最后用一条与miRNA序列特异的正向引物实现PCR扩增。第二种方法是利用茎-环状引物反转录miRNA，即stem-loop RT-qPCR检测法,茎-环状反转录引物中除含有一段与miRNA互补的特异性序列外,还含有一段较长的共有序列,与靶miRNA退火反转录后,能得到一个较长的反转录扩增子(cDNA),共有序列提供了一个通用引物结合位点,然后通过一个与miRNA序列特异的引物和一个通用引物实现PCR扩增。

然而，目前对miRNA定量研究多采用核糖体RNA(5S rRNA)和核仁小RNA作为定量参考，如RNU6，RNU43，RNU44和RNU48。但是，这些定量标准存在着明显的合理性问题，比如，核糖体RNA和小核仁RNA的片段长度为60-300nt之间，与miRNA的19-23nt明显不同，这种分子量上的差异可能会导致核仁小RNA对提取过程和酶促反应的反应性不同于miRNA。另外更重要的是，与miRNA分布于细胞质和EXOSOME不同的是核仁小RNA主要分布于细胞核内，其分布区域有明显的不同。因此，核糖体RNA和核仁小RNA用来做miRNA定量的参考并不合适。

基于以上背景，本发明人分别取3只熊猫0d，10d，20d，40d，60d所分泌的乳汁进行高通量测序，其中miR-128-2-3和miR-200a-3p在不同实验组之间表达最稳定。接下来本发明人应用实时定量PCR的方法，确定miR-128-2-3和miR-200a-3p在几个候选内参基因里稳定性表达最高，且丰度最高，从而鉴定出了适合熊猫乳汁检测应用的miRNA定量参考标准。

发明内容