[发明专利]一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂在审

申请号：	201811554952.2	申请日：	2018-12-19
公开（公告）号：	CN109682972A	公开（公告）日：	2019-04-26
发明（设计）人：	梅义武;刘兴;叶佳颖	申请（专利权）人：	浙江卓运生物科技有限公司
主分类号：	G01N33/574	分类号：	G01N33/574;G01N33/553;G01N33/543;G01N21/65;B82Y30/00;B82Y15/00
代理公司：	宁波市鄞州金源通汇专利事务所(普通合伙) 33236	代理人：	龚丹宇
地址：	315175 浙江省宁波市海曙区高***	国省代码：	浙江;33
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摘要：
搜索关键词：	乳腺癌肿瘤循环细胞种检测复合金属纳米金属纳米颗粒拉曼信号分子牛血清白蛋白巯基苯甲酸保存条件检测试剂离心洗涤血样靶分子还原型两步法三步法乳腺癌接枝外周修饰叶酸保存
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【权利要求书】：

1.一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂，其特征在于：包括以下步骤：

1）制备金属纳米颗粒MNSs

按重量份将60-70份金、10-15份银、10-15份铂、1-5份石墨烯、0.5-2份铋、0.1-0.5份钼以及0.1-0.5份钯溶于稀盐酸溶液中，加热至沸，待冷却后，离心弃去上清液，再离心洗涤两次，贮存在4℃冰箱中待用，利用ICP-OES测其金元素的浓度，将其浓度稀释至0.02 mg/mL；上述金属纳米颗粒的形状为金属纳米星，且定义为MNSs；

2）制备还原型牛血清白蛋白-叶酸复合物rBSA-FA

将叶酸FA、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS加入到PBS缓冲溶液中溶解，并在避光条件下搅拌反应8.0 h，即可得到活化的叶酸FA-NHS；接着将硼氢化钠逐滴加入到牛血清白蛋白中，在室温下搅拌反应持续1.0 h，即可获得还原型牛血清白蛋白，然后把上述还原型牛血清白蛋白加入到已经活化的叶酸FA-NHS的PBS缓冲溶液中，在室温下，反应4.0 h即可得到还原型牛血清白蛋白-叶酸复合物rBSA-FA，最后使用超滤离心管将反应后的溶液浓缩，并分散在超纯水中，4 °C储存待用；

3）制备SERS试剂

采用三步法或者两步法在金属纳米颗粒表面依次修饰拉曼信号分子4-巯基苯甲酸4-MBA、薄薄的一层还原型牛血清白蛋白rBSA、以及在还原型牛血清白蛋白层接枝靶分子叶酸FA，从而获得复合金属纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA-FA，最后经离心洗涤两次，最后分散在水相中，4 °C保存，利用ICP-OES测纳米粒子的金元素浓度，将其浓度稀释至0.5 mg/mL。

2.根据权利要求1所述的一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂，其特征在于：所述复合金属纳米颗粒的三步法制备方法包括以下步骤：

（1）拉曼信号分子4-MBA的修饰

把不同浓度溶于THF的4-MBA分别加入到金属纳米颗粒MNSs中，室温下搅拌反应2 min，即可获得修饰有4-MBA的纳米颗粒MNSs-MBA；

（2）亲水性大分子rBSA的修饰

将不同浓度的rBSA水溶液分别与MNSs-MBA混合，在室温下搅拌反应持续5.0 min，即可得到复合金属纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA；

（3）靶分子叶酸FA的偶联

将上述活化的叶酸FA加入到MNSs-MBA-rBSA分散液中，室温反应4.0 h，即可获得接枝有叶酸FA的复合纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA-FA。

3.根据权利要求1所述的一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂，其特征在于：所述复合金属纳米颗粒的三步法制备方法包括以下步骤：

（1）拉曼信号分子4-MBA的修饰

把不同浓度溶于THF的4-MBA分别加入到金属纳米颗粒MNSs，室温下搅拌反应2 min，即可获得修饰有4-MBA的纳米颗粒MNSs-MBA；

（2）复合物rBSA-FA的修饰

将不同浓度的rBSA-FA水溶液分别与MNSs-MBA混合，在室温下搅拌反应持续5.0 min，即可得到表面功能化rBSA-FA的复合金属纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA-FA。