[发明专利]一种无饲养层的大鼠精原干细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了一种无饲养层的大鼠精原干细胞的分离培养方法，从出生后7‑9天的雄性大鼠乳鼠睾丸中分离精原干细胞，通过差异贴壁和percoll分离可获得较高纯度的大鼠精原干细胞，所得大鼠精原干细胞使用无滋养层培养体系培养，可长期稳定传代且可向精子发生方向分化。本发明分离培养方法成本低、操作简便，获得的精原干细胞数量可倍增，对于不孕不育的治疗以及濒临灭绝物种资源的保护具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种无饲养层的大鼠精原干细胞的分离培养方法。

背景技术

精原干细胞是雄性哺乳动物睾丸内维持精子发生的根源，是一群能够维持自身数目的同时保持自身分化性能的生殖干细胞，可增殖并分化产生大量精子，且属于成体干细胞，可以在动物的体外经过诱导，重编程后变成多潜能干细胞。Kanatsu－Shinohara实验室在2003年成功建立了小鼠精原干细胞体外培养体系，经过10余年的发展，小鼠精原干细胞分离培养技术日臻成熟，但大鼠及人的精原干细胞并无稳定的高效分离与培养细胞系建立。大鼠作为一种常用的试验动物，相比小鼠具有许多诸如易于建造动物模型、易于取材等不可替代的优势，是重要的体内试验研究动物来源。

现有技术常用的分离培养大鼠精原干细胞方法，多数是以出生后7-9天的雄性大鼠为模型，直接用免疫磁珠法或借助流式细胞仪根据抗原抗体反应分选精原干细胞，并使用无血清培养基移种到滋养层细胞上传代培养。但是，现有方法存在多个弊端：第一，目前大鼠并无像小鼠一样的亲和且稳定的STO滋养层细胞系，现存实验多使用小鼠STO做大鼠精原干细胞的兼容性滋养层；第二，使用无血清培养基对培养基营养条件及离子稳定程度要求较高；第三，分离成本较高，由于分离得到的精原干细胞数量较少且纯度不足，要想得到更多的精原干细胞，需要长时间培养，因此，导致培养细胞的各项成本增加。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种高效分离大鼠精原干细胞的方法，成本低，操作简单，可以从大鼠睾丸中高效分离出高纯度精原干细胞并稳定培养。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种无饲养层的大鼠精原干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、原代分离大鼠精原干细胞：从出生后7-9天的雄性大鼠乳鼠睾丸中分离精原干细胞，通过差异贴壁和percoll分离获得大鼠精原干细胞，具体为：

取7-9天WISTAR雄性大鼠，剖开睾丸白膜，分离暴露曲细精管，加入4ml的HBSS溶解的10μg/ml的IV型胶原酶置于37℃消化；再使用3ml体积的300μg/ml的DNAse洗2-4次，600g离心后沉淀，加入4ml含1mM浓度EDTA的0.25％胰酶轻轻吹打37℃消化；10％血清终止消化后过筛网移除未消化的大块组织；于600g离心5分钟，弃去上清；将细胞以2ml培养基重悬后，加入到预先铺有50％、35％、25％、10％各1ml的percoll使用液的采血管中，整个percoll体系以600g离心50分钟；待离心后，可见50％与35％之间出现密集细胞带，吸出成带部分组分，HBSS清洗两遍后，以3×10⁷个/ml接种培养。

步骤二、对分离出的大鼠精原干细胞使用无饲养层培养体系培养，具体为：

采用含150ng/ml GFRα1、20ng/ml EGF、10ng/ml bFGF的10％血清DMEM/F12培养基，培养基补充成分为6g/L葡萄糖、25mg/L胰岛素、10^-4mol/L维生素C、10mg/L生物素、非必须氨基酸补充液、维生素补充液；4h后移取悬浮细胞组分单独培养，隔天换液，3-4天传代；待3-4日培养后，细胞融合至80％，移去半数上清液，将下层悬浮细胞轻轻吹起，收集后以1：2均匀传代并补充培养基。