[发明专利]一种在宫颈癌检测中应用的试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种在宫颈癌检测中应用的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括检测MSF1基因甲基化的试剂，所述检测MSF1基因甲基化的试剂是检测MSF1基因第2种转录本NM_001113493.1的第一个外显子上游225～305bp处的CpG岛区段甲基化的试剂。本发明所检测的MSF1基因的CpG区域在和MSF1基因的其他区域比较起来，宫颈癌中的阳性率最高；通过锁核酸修饰的PCR扩增引物能提高引物的Tm值从而高灵敏检出MSF1的甲基化DNA片段。

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及一种在宫颈癌检测中应用的试剂盒 及其应用。

背景技术

已有研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生的高危因素。通 过观察细胞形态的宫颈液基薄层细胞检测(TCT)联合HPV检测是目前临 床用于筛查宫颈癌的主要方法。TCT受人为干扰因素大，从取样-涂片-观察 -判读都受人为因素的影响；而HPV感染多提示短暂性感染，对预测宫颈癌 的发生价值相对较低。目前从肿瘤发生的分子机制入手来寻找肿瘤早诊的分 子标志物已经成为一种趋势。基因启动子区域CpG岛甲基化能使基因表达沉默，从而引起一系列细胞的分子水平事件。目前国际已经公认基因甲基化 是肿瘤发生进展过程中的早期事件。因此通过检测基因的甲基化对于预测细 胞的癌变已经开始应用在不同的肿瘤早期诊断上，例如通过外周血中游离 DNA的基因甲基化早诊大肠癌；通过分析肺泡灌洗液细胞中基因甲基化早 诊肺癌，等等。

发明内容

本发明提供一种在宫颈癌检测中应用的试剂盒，所述试剂盒包括检测 MSF1基因甲基化的试剂，所述检测MSF1基因甲基化的试剂是检测MSF1基 因第2种转录本NM_001113493.1的第一个外显子(位于1～363bp)的 225～305bp之间的CpG岛区段甲基化的试剂。MSF1基因第2种转录本 NM_001113493.1参见文献Theo deVos,Reimo Tetzner,FabianModel,et al., Circulating Methylated SEPT9DNA in Plasma Is a Biomarker forColorectal Cancer.Clinical Chemistry,2009,55(7):1337-46；第一个外显子(位于1～363bp) 的225～305bp之间序列为SEQ ID NO:1：

CCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGC CGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCC。

在一种实施方式中，所述试剂盒包括样品DNA提取试剂、DNA甲基化修 饰转化试剂以及基于荧光定量PCR方法检测MSF1基因甲基化的试剂，所述 基于荧光定量PCR方法检测MSF1基因甲基化的试剂是检测MSF1基因第2种 转录本NM_001113493.1的第一个外显子上游225～305bp处的CpG岛区段甲基 化的试剂。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括用PCR方法检测内对照参考基因 的试剂，所述内对照参考基因优选为ACTB基因；检测所述内参基因的试剂 包括一对非甲基化位点扩增引物、一条检测非甲基化位点探针。

在一种实施方式中，检测所述ACTB基因的试剂包括扩增ACTB基因引 物和探针：上游引物序列SEQ ID NO:2：ATAATAAAAAGGAGGTTGGAT； 下游引物序列SEQ ID NO:3：CTCCCRCAAAACAACCAC；和检测探针序列 SEQ ID NO:4：CCACCTTACCCTAAACACTACAAC。

在一种实施方式中，所述检测MSF1基因甲基化的试剂包括扩增MSF1基 因的一对在5’端锁核酸修饰的引物和一条检测甲基化位点的探针：上游引 物序列SEQ ID NO:5：+TT+T+AGTTAGCGCGTAGGGTTC；下游引物序列 SEQ ID NO:6：+AA+C+TAATAAACAACGAATCGCG；和检测探针序列SEQ ID NO:7：ACGCCCCCGACGAAACC。