[发明专利]Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法

说明书

本发明提供一种Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法。利用CRISPR‑Cas9基因敲除技术，敲除Ano5基因第11,12外显子。Ano5基因敲除后的小鼠均表现为胫骨侧弯、皮质骨增厚、下颌骨肥大和血液中碱性磷酸酶含量升高等多种人GDD患者临床表现。本发明构建的模拟人GDD疾病的小鼠模型，该模型稳定性强稳定遗传，与人类GDD疾病表现类似，可为进一步研究GDD发病机制以及基因治疗提供经济、简单、可靠的动物模型。

技术领域

本发明涉及病理学、遗传学和生物技术领域，具体地说，涉及一种Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法。

背景技术

GDD(Gnathodiaphyseal dysplasia)是一种病变累及口腔和长骨的显性遗传性疾病，表现为下颌骨牙骨质/骨发育不良或呈颌骨骨髓炎病理改变，管状骨侧弯、骨脆性增加和骨皮质增厚。GDD患者常在青少年时期发生骨折或反复骨折，血中碱性磷酸酶水平增高。Anoctamin 5(ANO5)基因是GDD的致病基因。近年来，有关GDD患病家系和散发病例的相关报道不断出现。由于该病给患者造成极大的痛苦，严重影响其生活质量，因此探讨GDD病因，进而指导疾病诊断、预防和治疗成为学者们关注的重点领域。

GDD是一种常染色体显性遗传疾病。2003年，Tsutsumi在一个日本大家系中，首次将致病基因定位于人类染色体11p14.3-15.1区域。随后，2004年在这个日本家系和另一个非裔美籍家系中发现位于ANO5(Anoctamin 5)/TMEM16E基因上的两个错义突变(p.C356R和p.C356G)。2012年，Marconi等在一个意大利GDD家系中，发现了ANO5基因上第三个错义突变p.T513I。前期研究中，发现中国GDD家系中的第一个ANO5基因突变p.C360Y。但迄今为止，对ANO5基因表达产物的功能及基因突变导致GDD的分子机制仍未阐明。

ANO5基因位于人类染色体11p14.3-15.1，编码913个氨基酸，属于Anoctamin蛋白家族成员(早期命名为TMEM16family)。TMEM16基因家族有一个共同特征结构--8个跨膜区域，在第五和第六跨膜区域形成了一个离子通道。在人体组织中，Ano5基因的mRNA在脑、心脏、骨骼肌中检测到表达；在成年小鼠的颅盖骨，股骨和下颌骨中也有表达。根据Tsutsumi等人和Mizuta等人的研究，认为ANO5蛋白可能是一个完整的膜糖蛋白，主要驻留在细胞内的膜性囊泡内和质膜上，可能是内质网，但是具体机制还不清楚，突变是否会导致ANO5蛋白定位发生改变也不清楚。因此，利用动物模型研究GDD疾病可以为人类GDD疾病的诊断、治疗提供理论基础。

目前，Ano5基因敲除的动物模型主要有Griffin通过敲除第8、9外显子和Xu通过替换第1外显子及其上游1.6kb序列建立的两种小鼠模型，然而这些模型只介绍了Ano5有关的肌肉相关疾病的表型改变，并未发现有任何骨组织的改变。

发明内容

本发明的目的是提供一种Ano5基因敲除小鼠模型，特别是模拟人类GDD疾病的小鼠模型的构建方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于敲除小鼠Ano5基因的CRISPR-Cas9系统，所述CRISPR-Cas9系统中sgRNA作用位点位于Ano5基因的11和12号外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为5′-CCTGGGATGTTATCTGGCTTGC-3′和5′-CCAGGGATGTGTGCACACTAGGC-3′。

第二方面，本发明提供小鼠Ano5基因打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA作用位点位于小鼠Ano5基因的11和12号外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为5′-CCTGGGATGTTATCTGGCTTGC-3′和5′-CCAGGGATGTGTGCACACTAGGC-3′(SEQ ID NO:1-2)。

第三方面，本发明提供所述CRISPR-Cas9系统或所述打靶载体在制备Ano5基因敲除的细胞系中的应用。