[发明专利]一种质粒以及噬菌体辅助的连续定向进化系统和定向进化方法

说明书

本发明涉及膜蛋白定向进化领域，特别涉及一种质粒以及噬菌体辅助的连续定向进化系统和定向进化方法。一种质粒，包括AP1质粒和AP2质粒中的一种或两种；AP1质粒携带gIII基因，并且该质粒的启动子与核糖体结合位点之间设置有功能蛋白识别位点；AP2质粒携带功能蛋白基因。本发明设计新的辅助质粒AP1和AP2，将目标蛋白对胞内外底物分子的转运活性与AP1上的gIII表达偶联，通过这种间接的方式将SP的繁殖能力与目标蛋白的活性偶联，达到连续定向进化目的蛋白的效果。

技术领域

本发明涉及膜蛋白定向进化领域，具体而言，涉及一种质粒以及噬菌体辅助的连续定向进化系统和定向进化方法。

背景技术

在基因组中，大约有30％的基因产物是膜蛋白，这个比例显示膜蛋白在生物体中的重要性。膜蛋白主要包括信号受体、转运蛋白、离子通道蛋白及一些酶类，对细胞代谢、生理平衡、胞内调节至关重要。在药物研发设计过程中，很多膜蛋白是药物设计的靶点，然而膜蛋白结构及生化信息的匮乏制约了药物设计的发展，因为膜蛋白的不稳定性及不溶性导致科研人员很难获得高纯度的膜蛋白进行其三维结构的解析及研究。针对膜蛋白的这些特性，定向进化或许可作为强有力的工具帮助科研人员理解膜蛋白结构及其生物功能的关系。

传统的诱变及基因重组的方式进化膜蛋白耗时耗力，需要建突变库，反复筛选进行(Journal of Theoretical Biology,2000,205(3):483-503)。当前较新颖的脂质体展示等方式操作复杂，还需引入昂贵的体外翻译系统，成本较高(Biophysics,2015,11:67-72)。

哈佛大学David R Liu团队发明了一种噬菌体辅助持续进化系统(PACE)。该系统主要包含三个部分，第一部分将需要进化的基因置于噬菌体M13基因组上并替换原有的gIII基因，形成SP，SP缺少gIII无法侵染宿主并产生子代噬菌体；第二部分将SP侵染及产生子代噬菌体所需的gIII基因置于额外的质粒上进行表达，形成辅助质粒AP，gIII的表达受SP上的目的基因活性的调控，即将SP在细胞内的繁殖能力与目的基因的生物活性偶联在一起；第三部分是诱变质粒MP，利用阿拉伯糖诱导物诱导MP上的基因DNAQ926、dam和seqA表达，使DNA复制过程中错误碱基不能修复，突变率提高几百倍。当带有目的基因的SP侵染宿主后，SP在宿主胞内进行遗传物质的复制，在MP的帮助下，会产生SP的各种突变体。若SP上的目的基因获得正向突变，则AP质粒上的gIII蛋白表达，能够包装出具有侵染性的子代SP噬菌体并分泌到胞外，进入下一轮的侵染、突变、子代循环；若SP上的目的基因不突变或者负面突变，则AP质粒上的gIII蛋白不表达，产生的子代不分泌到胞外或者数量较少；进化池是以一定流速持续被稀释，正面突变的SP可以持续产生子代并保留在池中，负面突变的SP会不断被流出池中并消失。David R Liu团队用PACE系统成功进化了T7RNA聚合酶(NATURE.2011April；472:498–505)、蛋白酶(Nature Communications,2014,5:5352.)、DNA结合蛋白(Nature Methods,2015,12(10):939.)等并赋予这些蛋白新的特性，但并未涉及膜蛋白领域，现存的PACE系统并不适合对膜蛋白进行定向进化。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明设计新的辅助质粒AP1和AP2，AP2上的功能基因表达的蛋白抑制AP1上gIII蛋白的表达，转运蛋白将底物转运进胞内，底物分子可以解除功能蛋白的抑制效果，即将转运蛋白对胞外底物分子的转运活性与AP1上的gIII表达偶联，通过这种间接的方式将噬菌体的繁殖能力与转运蛋白的转运活性偶联，达到连续定向进化目的蛋白的效果。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种质粒，包括AP1质粒和AP2质粒中的一种或两种；

AP1质粒携带gIII基因，并且该质粒启动子与核糖体结合位点之间设置有功能蛋白识别位点；