[发明专利]一种植物降解组文库构建方法

说明书

本发明公开了一种植物降解组文库构建方法，5’RNA接头中含有Ecop15I酶的识别位点，由Ecop15I酶切，文库插入片段长度为27个碱基，5’RNA接头序列为GUUCAGAGUUCUA CAGUCCGACGAUCAGCAG，其中下划线部分是EcoP15I酶的识别序列，双链DNA接头序列的上链：5’NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG 3’，下链：5’CCTTGGCACCCGAGAATTCCA 3’，由于5’RNA接头序列及双链DNA接头序列的改变，所构建的植物降解组文库能够采用Illumina TruSeq小RNA文库测序方法进行测序，因此测序简便易行。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种植物降解组文库构建方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是真核生物中具有重要调控机能的一种小分子RNA(Yu Y等，The'how'and'where'of plant microRNAs.The New Phytologist,2017,216(4):1002-1017)。植物miRNA与植物的生长、发育、代谢以及生物和非生物胁迫存在着密切的联系(Sunkar R等，Functions of microRNAs in plant stress responses.Trends in PlantScience 2012,17(4):196-203)。miRNA需通过调控其靶基因发挥作用，植物miRNA与其调控的靶基因mRNA有着完美或近似完美的互补配对关系，并主要以介导靶基因mRNA在miRNA对应的第10-11位碱基之间被剪切的方式对靶基因进行调控(Xie M等，microRNAbiogenesis,degradation and activity in plants.Cellular and molecular lifescience,2015,72(1):87-99)。因此，对植物miRNA靶基因的分析和验证是研究miRNA功能必不可少的一部分。靶基因可通过生物信息学方法(Ding J等，Finding MicroRNA Targetsin Plants:Current Status and Perspectives.Genomics Proteomics Bioinformatics,2012,10(5):264-275)进行预测，然而，理论上预测的靶基因尚需通过实验验证才能确认。RLM-5'RACE(RNA ligase-mediated 5'rapid amplification of cDNA ends)(Llave C等，Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class of ArabidopsismiRNA.Science,2002,297(5589):2053–2056)是验证miRNA靶基因的经典方法。其原理是miRNA介导的靶基因mRNA被降解时会产生2个片段(5'剪切片段和3'剪切片段)，其中3'剪切片段比较稳定，有一个暴露的5'单磷酸基团和polyA尾巴。用RNA连接酶在5'磷酸基团处连接一个RNA接头，经反转录、PCR、克隆和测序，则可确定待测基因是否为miRNA的靶基因(Llave C等，Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class ofArabidopsis miRNA.Science,2002,297(5589):2053–2056)。RLM-5'RACE对于验证少数靶基因时非常实用，然而其缺点是每次只能验证一个靶基因，当要验证大量靶基因时则费时费力。而降解组测序(degradome sequencing)则结合了RLM-5'RACE、高通量测序和生物信息学分析的优势，可以在整个转录组水平对细胞或者组织中miRNA介导的mRNA的3'剪切片段进行深度分析，因此是研究miRNA靶基因的最实用、最高效的技术手段。