[发明专利]一种MEF2D1-97载体及其构建方法和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种MEF2D 1‑97载体及其构建方法和应用。本发明提供的MEF2D 1‑97载体，是将MEF2D 1‑97片段人工合成后插入到pCMV6‑entry中构建而成。本发明提供的MEF2D 1‑97载体可以作为DYRK1A蛋白活性指示剂，检测DYRK1A蛋白活性。本发明提供的MEF2D 1‑97载体具有转化效率高，成本低，构建方法简单等优点，同时本发明首次利用MEF2D 1‑97载体检测DYRK1A蛋白活性，对环境污染较少，并且稳定性好，灵敏度高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种MEF2D1-97载体及其构建方法和应用。

背景技术

MEF2D蛋白属于肌细胞特异性增强因子家族(MEF2)成员，该家族成员包括MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D，均为具有重要生物学功能的转录因子。早期研究表明，MEF2蛋白参与肌肉和神经细胞的分化及发育，与急性白血病的发病也有相关性，MEF2蛋白还参与多个涉及细胞存活及凋亡的信号通路，如MAPK-p38通路、CDK5、ERK5，AMPK及Caspase通路等。对人类的癌症研究发现，MEF2D在人肝癌中高表达，并促进肝癌细胞的增殖，MEF2D被敲减后肝癌细胞的增殖水平降低，细胞阻滞在G2/M期；MEF2D在肺癌中表达量也很高，降低其表达量也会影响肺癌细胞的增殖、存活及侵袭；胰腺癌中MEF2D的表达也远高于癌旁组织，且MEF2D的表达量与肿瘤的大小、组织分化程度及所处肿瘤分期阶段具有显著相关性，胰腺癌细胞系中敲除MEF2D，会抑制细胞的增殖、迁移及侵袭能力，MEF2D表达量降低也会减少磷酸化Akt和GSK-3β的水平。MEF2D表达与CD31阳性的结直肠癌组织中微血管密度具有正相关性，MEF2D会诱导结直肠癌细胞中促血管新生因子的表达，促进肿瘤中血管生成；很多miRNA也通过靶向调节MEF2D对癌症细胞的功能进行调控，比如miR-30a通过降低MEF2D的mRNA及蛋白表达，抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭，miR-421通过抑制MEF2D的表达抑制恶性胶质瘤的糖代谢、血管生成等功能。众多的研究结果提示，MEF2D对多种癌症的发生发展以及癌细胞的生物学功能，具有重要作用。

双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)基因，位于人类21号染色体的唐氏综合征关键区域(Down Syndrome critical region，DSCR)，属于双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶家族，是果蝇mnb基因(小脑基因)在哺乳动物中的同源基因。DYRK家族蛋白在调控细胞增殖的核功能的信号通路中起重要作用。DYRK1A可以催化自体丝、苏氨酸和酪氨酸磷酸化，不仅参与大脑的发育，在调控细胞增殖的细胞通路中也具有重要作用，是唐氏综合征(DS)的重要候选基因之一。DYRK1A的表达量及活性对细胞功能至为重要。DYRK1A通过发挥其激酶活性，磷酸化下游底物而参与细胞功能调控。因此DYRK1A的活性检测，意义重大。

目前的研究多是通过检测DYRK1A的自体酪氨酸磷酸化水平指示其激酶活性，应用免疫沉淀技术结合Western Blot(WB)技术，通过与对照相比磷酸化条带的强弱水平，确定DYRK1A激酶活性的大小。该方法的弊端在于，操作步骤较为繁琐复杂，细胞裂解时要在裂解液中及时添加足量的仍处于效期内的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂已减缓蛋白的降解以及磷酸化蛋白的去磷酸化速率，从收集细胞、细胞裂解、离心至免疫沉淀反应等需要全程保持在0-4℃条件下操作，且反应用时长，通常需要四小时至过夜孵育，长时间暴露于4℃环境即使在有蛋白酶抑制剂的条件下仍易导致蛋白降解。且免疫沉淀实验需要大量的裂解液，也需要琼脂糖珠，磷酸化抗体作为蛋白修饰抗体，与同规格普通蛋白抗体相比具有价格高昂，活性不够稳定、存放时间短等缺点，对结果的准确性有一定的影响。

其次，还可以通过检测DYRK1A的底物磷酸化水平来间接的反映DYRK1A的激酶活性。同样需要经过裂解细胞，蛋白定量并结合WB等方法，通过蛋白磷酸化抗体或者直接通过放射自显影来检测DYRK1A底物的磷酸化水平。蛋白磷酸化抗体依然存在以上描述的弊端，而放射自显影更需要放射性标记的³²P，对检测者存在一定的射线危害。