[发明专利]一种基于逻辑判断的原子尺度DNA测序方法

说明书

本发明提供了一种DNA测序方法，该方法采用单壁碳纳米管作为测序通道，且该通道的长度每次仅能容纳两个碱基对，测序通道内的碱基对只能有4种组合，分别为(CG，CG)、(CG，AT)、(AT，CG)、和(AT，AT)，相应地，测序通道内碱基对间的氢键个数分别为6、5、5、4，不同数量的氢键使碱基对碳纳米管的作用力不同，进而影响碳纳米管的声子谱。对于具有5个氢键的组合，需对其相邻碱基进行逻辑判断，实现对DNA的单个碱基对的测序。目前常规固态纳米孔由于通道太长无法实现对单个碱基分辨，而采用二维纳米孔虽能对单个碱基或碱基对进行检测，但检测信号分辨率过低。该测序方法有效解决了常规固体纳米孔存在的不足，提高了单对碱基的分辨率。

技术领域

本发明涉及的是一种基于逻辑判断和声子谱测量的单壁碳纳米管对双链 DNA的测序方法，通过检测碳纳米管的声子振动图谱(实验上通过检测纳米管的拉曼光谱)，实现在原子层次对双链DNA分子的快速测序，该发明属于第四代 DNA测序方法。

背景技术

DNA测序技术是一种分析特定DNA片段的碱基对排列方式的技术。该测序技术具有快速、精准和低成本等优势，有利于DNA测序的广泛应用，如用于疾病诊断、生物技术以及对重要物种的基因测序等。

纳米孔测序(nanopore sequencing)是第四代DNA测序技术。该技术是利用电泳驱动DNA分子通过纳米孔，并通过阻塞电流法、电容法及隧道电流法等来检测不同类型碱基通过纳米孔时导致的物理参数的变化。目前制备纳米孔的材料主要分为两类，一类是生物纳米孔，即天然的或人工改造过的蛋白质分子，如α溶血素、MpsA蛋白和phi29DNA聚合酶等。另一类是采用微加工技术制备的固态纳米孔，如氮化硅、聚乙烯亚胺(PEI)、二硫化钼和石墨烯等。尽管生物纳米孔可以识别单链DNA上的单个碱基，但蛋白质容易受环境的影响，如环境的 pH值、温度和机械振动等均能使蛋白质发生变性，除此之外，蛋白质纳米孔具有不能承受较高的电压、错误率较高和易老化等缺点，这些因素均限制了生物纳米孔在DNA测序中的应用。固态纳米孔不具备生物纳米孔中存在的上述缺点，更重要的是可以将其进行批量生产和器件集成。然而，由于传统的固态纳米孔测序通道太长，无法实现对单个碱基的分辨。目前已经通过大量的理论计算发现，以石墨烯为代表的新一代二维材料纳米孔，用于DNA测序具有诸多优点，但由于DNA容易粘附在孔侧，且检测的电流信号强度也不够高，导致很难对单碱基进行分辨。人们发现单壁碳纳米管通道内简单的环境和完美均匀的石墨壁能为 DNA测序提供一个良好的平台，近年来，单壁碳纳米管也被用来进行DNA测序。然而，目前用于DNA测序的单壁碳纳米管与传统固态纳米孔一样，均具有测序通道太长的特点，也无法实现对单个碱基的分辨。到目前为止，采用固态纳米孔进行DNA测序的目标还远远没有实现。

通过理论计算的研究证实，纳米孔测序可以通过测量离子电流、电子隧穿电流或平面内电流来实现超高速测序，但这一方案还未得到实验证明。这是因为，要实现利用纳米孔测序的目标，必须克服两大障碍。首先，DNA在纳米孔的易位速率相较于实验中所能测得的信号带宽和噪声水平来说仍太快。因此，要想实现纳米孔测序，DNA易位的速度必须减慢或降低信号噪声。其次，核苷酸或碱基的二级和三级结构在纳米孔附近或内部形成，导致纳米孔测序的不同碱基之间的信号重叠，进而难以实现对单碱基分辨率。因此，为了提高DNA测序的分辨率，一方面需要避免DNA在纳米孔附近形成新的二级或三级结构，同时也要增加DNA 在纳米测序通道内的滞留时间，这是目前DNA测序技术需要解决的关键技术问题。

发明内容

本发明首次提出从原子尺度的逻辑关系出发，利用DNA不同碱基对间氢键数量的不同，从而对碳纳米管的作用力不同，进而影响碳纳米管的声子振动模式，最终需结合碳纳米管振动模式的差异实现对DNA单碱基对的测序。对碳纳米管声子振动模式的检测实际上是对其内氢键数量的检测，而氢键是生物分子间最强的一种分子间作用力，相比于常规固体纳米孔对电子电流信号的检测，对氢键信号的检测可以大大提高信号强度。本发明的目的在于提供一种新的DNA测序方法，弥补采用现有固态纳米孔进行DNA测序的不足，使固态纳米孔测序成为一种快速、低成本、高精度的DNA测序方法。