[发明专利]一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法

说明书

本发明公开了一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，包括收集外围血、cik免疫细胞分离、获取单个核细胞、配置诱导培养基和诱导扩增培养。本发明的有益效果是：步骤B中，离心操作为1500rpm离心五分钟，使cik免疫细胞能够彻底分离，提高分离率，激活培养基为添加了第一血浆、白介素‑2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且白介素‑2的浓度均为900IU/ml，扩增培养基为添加了白介素‑2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且沙培林的浓度均为0.01KE/ml，cik免疫细胞的诱导和增殖速度更快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，步骤D中，所添加的胎牛血清胎牛血清体积浓度为15％，且还含有抗生素，能够提高cik免疫细胞扩增的效率，同时扩增后的cik免疫细胞具有较高的纯度。

技术领域

本发明涉及一种诱导扩增方法，具体为一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，属于生物技术领域。

背景技术

CIK免疫细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKiller，CIK)，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点，该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞，尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案，CIK免疫细胞扩增能力限制了其在临床上进一步的推广应用。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，包括以下步骤

步骤A：收集外围血，筛选体检合格的供者，由医护人员使用注射器抽取适量血液，并保存备用；

步骤B：cik免疫细胞分离，将上述采集的外周血进行离心分离，除去上清，下层液体中加入PBS缓冲液，混匀后缓慢加入淋巴分离液，并再次离心，获得PBMC；

步骤C：获取单个核细胞，用巴斯德吸管将PBMC层吸出，在新的离心管中加入PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用PBS清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀后1000rpm离心6min，弃上清；

步骤D：配置诱导培养基，在基础培养基内添加胎牛血清组成混合液，并分别配置激活培养基与扩增培养基；

步骤E：诱导扩增培养，利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器，将单个核细胞置于包被后的培养容器中，并添加诱导培养基进行免疫细胞激活培养，以便得到初代诱导扩增的cik免疫细胞，再将初代诱导扩增的cik免疫细胞分置于多个包被后的培养容器中，再次添加诱导培养基进行免疫细胞激活培养，即可实现cik免疫细胞的体外诱导扩增。

优选的，为了使cik免疫细胞能够彻底分离，所述步骤B中，离心操作为1500rpm离心五分钟。

优选的，为了有利于cik免疫细胞的体外高效扩增培养，所述步骤D中，基础培养基为OpTmizer TMCTSTM无血清培养基或SuperCulture TML500人淋巴细胞无血清培养基。

优选的，为了使cik免疫细胞的诱导和增殖速度更快，且扩增效率高，所述步骤D中，激活培养基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且白介素-2的浓度均为900IU/ml，扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基，且沙培林的浓度均为0.01KE/ml。

优选的，为了能够提高cik免疫细胞扩增的效率，所述步骤D中，所添加的胎牛血清胎牛血清体积浓度为15％，且还含有抗生素。