[发明专利]一种增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法

说明书

本发明公开了一种增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法，属于生物工程领域。本发明通过在弗托葡糖杆菌HD924中利用组成型启动子sldAp过量表达Bacillus lentus 168来源的葡萄糖脱氢酶基因gdh，同时在培养基中添加一定浓度的L‑葡萄糖，使重组菌细胞干重提高了21.2％。过量表达gdh基因的重组弗托葡糖杆菌二羟基丙酮产量、生产强度、甘油利用率、胞内NADH浓度均有显著的提升。

技术领域

本发明涉及一种增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法，属于生物工程领域。

背景技术

弗托葡糖杆菌(Gluconobacter frateurii)HD924为革兰氏阴性菌，专性好氧，属于葡糖杆菌属。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.5397。该菌株具有优良的二羟基丙酮生产性能，好氧条件下二羟基丙酮产量可以在达到170g/L以上(CN，201110388519)。该菌株已经在长兴制药股份有限公司进行工业生产，是生产二羟基丙酮的工业菌株之一。刘宇鹏等(Bioresource technology 2013,142:384-389)研究发现，弗托葡糖杆菌HD924发酵过程中最大生物量OD560只有8.7。提高发酵过程中的生物量能够提高菌体生产二羟基丙酮的生产强度，目前促进弗托葡糖杆菌生长的方法主要是优化菌体的培养基组成和生长条件。

葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase，[EC:1.1.1.47]GDH)，是一种NAD+和NADP+辅酶依赖型蛋白。GDH能够催化葡萄糖脱氢氧化成葡萄糖酸，并将氧化态的NAD+和NADP+还原为NADH和NADPH，促进NAD+和NADP+再生，为细胞的生长提供还原力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中弗托葡糖杆菌HD924在发酵二羟基丙酮过程中的生物量低的缺陷，提供一种增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

在弗托葡糖杆菌HD924中通过构建的重组质粒pBBR-sldAp-gdh过量表达Bacilluslentus 168来源的葡萄糖脱氢酶基因gdh，同时在培养基中添加一定浓度的L-葡萄糖。所述的重组质粒pBBR-sldAp-gdh是甘油脱氢酶基因启动子sldAp、gdh基因克隆在pBBR1MCS-4质粒的SacI和EcoRI的酶切位点之间，其物理图谱如附图1所示。所述的gdh基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列中包含该基因自身的终止子。所述的过量表达是通过弗托葡糖杆菌来源的甘油脱氢酶基因组成型启动子sldAp控制gdh在弗托葡糖杆菌细胞内进行组成型表达。sldAp的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

以甘油为底物发酵生产二羟基丙酮过程中，过量表达gdh的重组菌与野生菌株HD924相比，细胞干重提高了21.2％，发酵12h、18h和24h的胞内NADH分别提高了3.1、2.6和1.8倍。发酵48h，二羟基丙酮的生产强度提高了14.2％。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是pBBR-sldAp-gdh质粒物理图谱。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

本实施例中以G.frateurii HD924为实验菌株，Bacillus lentus 168购自美国模式菌种收集中心。