[发明专利]基于转录组测序开发的黄杜鹃SSR引物对及筛选方法与应用

说明书

本发明公开了基于转录组测序开发的黄杜鹃SSR引物对及筛选方法与应用。属于生物技术领域。该引物是基于转录组测序和序列分析得到，在转录组测序的基础上，对大量数据进行筛选，获取富含SSR位点的unigene序列并进行SSR标记的引物设计，克服了目前黄杜鹃SSR分子标记数量少、开发效率低的障碍。利用黄杜鹃群体验证SSR引物的有效性，为黄杜鹃遗传多样性研究、遗传连锁图谱构、QTL定位、分子标记辅助育种等遗传学研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于转录组测序开发的黄杜鹃SSR引物对及筛选方法与应用。

背景技术

黄杜鹃(Rhododendron molle G.Don)，又名羊踯躅、闹羊花、闷头花、羊不食草、八里麻、老虎花，属于杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron)黄杜鹃亚属(Subgenuspentanthera)的落叶灌木。黄杜鹃的种子细小，发芽出苗困难，人工扦插以及分株繁殖均很难成活,因其药用价值而导致的人为采挖，使得野生黄杜鹃现存量锐减，甚至处于濒危状态，属于国家级保护植物。黄杜鹃树枝优美、花冠硕大、色泽鲜艳，花为五裂漏斗状，极具观赏价值，是重要的园林绿化和观赏植物，也是欧美国家重要的杜鹃育种资源。黄杜鹃全株器官均有药用价值，能够舒筋活络、镇痛、祛风、除湿、止咳、散淤，是治疗风湿病的珍贵药材，含有的闹羊素是高效的药用杀虫剂，具有极高的药用价值，因此具有巨大的开发潜力和应用前景。分子标记技术在品种鉴定、遗传图谱构建、目标基因定位、分子标记辅助育种等领域应用广泛，是花卉研究和育种应用的重要技术手段，但是目前黄杜鹃育种中能用的分子标记数量较少，极大地限制了其在黄杜鹃遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱构建、分子标记辅助育种中快速、有效的应用。

简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)在真核生物基因组上广泛分布，是由1-6个核苷酸组成的串联重复序列具有多态信息量高、共显性遗传、重复性好、特异性强和技术简单等特点，在遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱构建、分子标记辅助育种研究中应用广泛。SSR标记根据存在的位置可分为基因组SSR(gSSR)和表达序列标签SSR(EST-SSR)。由于黄杜鹃的基因组信息尚未测序或者测序数据尚未公布，而同源物种开发的SSR标记尚无确定是否可以在黄杜鹃内跨物种使用，所以利用转录组数据获取SSR分子标记更加经济、快速、海量。此外，EST-SSR标记来源于DNA的转录区域，相比gSSR具有更高的通用性且此种类标记经常与功能基因连锁，在分子标记辅助育种和重要目标性状关联分析上均有较高的应用价值。

第二代高通量测序技术的发展与成熟使得通过转录组测序高通量获取EST-SSR标记成为了可能。目前尚未有利用黄杜鹃转录组数据海量开发多态性SSR标记的相关报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供基于转录组测序开发的黄杜鹃SSR引物对及筛选方法与应用。本发明利用RNA-seq技术对黄杜鹃花瓣材料进行转录组测序，将数据组装拼接后挖掘含有SSR标记的序列，并将符合SSR引物设计要求的unigenes进行SSR标记的开发，并随机合成部分SSR引物，进行适用性验证。该引物的开发为黄杜鹃的遗传多样性和遗传结构研究、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、重要性状基因定位和克隆等研究奠定基础。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，提供一种基于转录组测序开发的黄杜鹃EST-SSR引物对，在检测过程中使用30对引物，所述引物分别为：

表1.30对黄杜鹃的成套EST-SSR引物对

。

第二方面，提供上述黄杜鹃EST-SSR引物对的下述A1-A6中的任一种用途：

A1、所述EST-SSR引物对在构建黄杜鹃遗传图谱中的应用；

A2、所述EST-SSR引物对在黄杜鹃种质鉴定中的应用；