[发明专利]一种治疗性HPV核酸疫苗

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种治疗性HPV核酸疫苗及其制备方法。本发明的HPV E6/E7微环DNA中包含HPV16和HPV18亚型的E6和E7蛋白的核苷酸序列，并通过对E6和E7序列的剪切和重排消除其致癌能力；通过在E6和E7重排序列上游增加Flt3L序列区，增强了HPV E6/E7的免疫原性。同时，本发明采用的微环DNA具有以下优点：1)不整合入宿主细胞基因组，不会诱发新的突变，较病毒载体更为安全；2)可在工程细菌内大量扩增，制备工艺简单，产业化生产成本低；3)表达外源基因较传统质粒稳定，高效。本发明的HPV E6/E7微环DNA用于制备疫苗对于HPV感染的治疗有重要意义。

本专利为发明“一种治疗性HPV核酸疫苗”的分案申请，原案申请号为：201810186910.1，申请日期为20180307。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种治疗性HPV核酸疫苗。

背景技术

宫颈癌占女性妇科恶性肿瘤的第二位，现已成为威胁女性健康的重要疾患，中国每年死于宫颈癌的人数将近5万，宫颈癌的病因研究一直为国内外学者所重视，研究发现引起宫颈癌的关键是HPV的感染。HPV属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属，是球形、双链环状DNA病毒。HPV主要通过直接或间接接触污染物品或通过性传播感染人类。HPV的感染有宿主特异性和组织特异性，只能感染人类的皮肤和粘膜受损的基底细胞。

HPV至今已鉴定明确的大约有200多个亚型，根据其致病和预后不同又可分为高危型HPV(HR-HPV)和低危型HPV(LR-HPV)，其中HR-HPV 15种，包括HR-HPV16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、53、58型等，感染后可引起癌前病变和宫颈癌。其中HPV16和HPV18是最主要的流行株。HPV 16型和HPV 18型可导致约70％的宫颈癌病例、80％的肛门癌、60％的阴道肿瘤和40％的外阴癌。只有持续的HR-HPV的感染才是宫颈癌的主要因素。

HR-HPV的持续感染，使HR-HPV DNA与宿主宫颈基底膜细胞DNA整合，引起HR-HPVE2片段(E2基因参与转录调节，E2蛋白是主要的病毒转录因子)的缺失，E2片段的缺失加快宫颈病变的进展，增加恶性转化的可能性，主要原因是E2片段的缺失引起HPV E6/E7mRNA表达，E6/E7蛋白促进﹑维持HR-HPV DNA与宫颈基底细胞DNA整合，使宫颈基底细胞异常增生，HPVE6/E7mRNA干扰正常细胞周期，导致细胞基因组不稳定，转录生成的E6/E7蛋白，可以灭活抑癌蛋白P53、RB和P21等，使正常的宿主细胞向恶性方向转化，E6/E7蛋白可以使HPV逃避宿主的免疫监视以及干扰机体免疫反应。E6/E7蛋白为癌蛋白，因此可以针对E6/E7蛋白开发治疗HPV感染的药物，以防发展为宫颈癌。

DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表达载体，可直接注射到动物体内的第三代疫苗。其使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。

目前预防性疫苗Gardasil/Cervarix可有效预防HPV感染，但对于已有HPV感染或癌前病变者并无明显治疗作用，故有必要开发针对HPV感染相关癌前病变的治疗性疫苗。

因此本发明开发一种治疗HPV感染的HPV E6/E7微环DNA疫苗，E6/E7的致癌能力已被消除，并增强了其免疫原性，并且所用的微环DNA(MC)是安全、高效的理想载体。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种HPV E6/E7核苷酸片段，其消除E6/E7致癌能力，并保存E6/E7的免疫原性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明选择了HPV最主要的流行株HPV16和HPV18，通过对其编码E6和E7蛋白的核苷酸序列的剪切和重排消除其编码的蛋白的致癌能力，同时保留了E6和E7的抗原决定簇，保持其免疫原性。