[发明专利]一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法和装置

说明书

本发明公开了一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法和装置，属于光学成像技术领域，通过普通的共聚焦显微技术对样品进行成像，得到样品在轴向位置的第一幅二维图像；然后，对入射的光束进行相位调制，得到中空的光束，使用中空的光束对样品进行共聚焦成像，得到该轴向位置的第二幅二维图像。然后使用盲卷积的算法，将两幅图像恢复。通过一个较小的相减系数，从恢复后图像减去第二幅图像，得到一个具有很小的负值较小的相减结果，将结果中的负值进行归零之后，可以得到该轴向位置的二维图像的最终结果。随后，改变成像的轴向位置，得到多幅二维图像，对这些图像进行三维重构。相减后产生的负值较小，减少了由于负值归零造成的有效信息的丢失。

技术领域

本发明涉及光学成像技术领域，具体地说，涉及一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法和装置。

背景技术

1957年，美国科学家马文·闵斯基最早提出了共聚焦显微技术，并为其申请了专利，随着相关技术的发展，共聚焦显微技术也逐步发展成熟，目前已经成为生命科学领域最为常用的研究工具之一。

虽然相较于传统的宽场显微技术，共聚焦显微技术在各个方向上的分辨率都有所提高，但是它仍旧无法突破衍射极限的限制。而随着生物研究的不断深入，对样品细微结构的研究需求，对光学显微镜的分辨率提出了更高的要求，促使了一系列超分辨显微成像技术的发展，如受激发射损耗荧光显微技术(STED)、基态耗尽显微技术(GSD)、可逆饱和光转移荧光显微技术(RESOLFT)、随机光学重建显微技术(STORM)等。

以上显微技术虽然成功地突破了衍射极限，但也存在一定的缺点：它们的光学系统相对复杂、设备昂贵；只能对特定的荧光分子进行成像，对样品具有特定的要求；对样品的光漂白和光毒性较强。

而差分的方法克服了上述的缺点，为共聚焦显微技术的分辨率提高提供了一种新的出路。在这种方法中，先后使用高斯光束和中空的光束对样品中的荧光进行激发，产生两个图像，再将这两幅图像以一定的相减系数做减法，得到最终的成像结果。这种方法的优势在于：它可以通过对原本的成像系统进行简单改造实现，成本较低；它的计算也十分简单，只需要进行简单的减法；它对荧光染料也没有特定的要求，适用范围更广。

但是在两幅图像在相减的过程中，会产生一定的负值，随着分辨率提高，负值也会相应地增大。一般而言，我们将这些负值简单地归零，来避免最终结果中的负成像强度。但是，这种方法会丢失一部分有效信息，甚至可能造成最后成像结果的扭曲变形。

发明内容

本发明的目的为提供一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法，利用该方法可以减小普通差分方法中负值归零造成的信息丢失。

本发明的另一目的为提供一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像装置，该装置用于实现上述差分共聚焦显微成像方法。

为了实现上述目的，本发明提供的基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法包括以下步骤：

1)激光光束进入共聚焦荧光显微镜光路中，通过振镜对样品进行轴向扫描，对样品各扫描位置进行成像，得到样品的二维共聚焦成像结果I_confocal；

2)在共聚焦荧光显微镜的照明光路中，对激光光束进行相位调制，在垂直于光轴的截面上形成中空光斑，利用步骤1)的方法得到样品的二维中空光束成像结果I_donut；

3)使用盲卷积算法对二维共聚焦成像结果I_confocal和二维中空光束成像结果I_donut进行恢复，得到恢复后的图像I_restored；

4)使用相减系数α_s，从图像I_restored中减去中空光束成像结果I_donut，并将得到的结果中的负值归零，得到最终二维图像I_final，即