[发明专利]一种枯草芽孢杆菌全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明成功实现了苯丙氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶在枯草芽孢杆菌中共表达的构建。全细胞转化L‑苯丙氨酸可生产10.0g/L苯乳酸，转化率为40％。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成苯乳酸的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)，又称β-苯基乳酸、3-苯基乳酸，即2-羟基-3-苯基丙酸，是一种广泛存在于自然界中的小分子天然有机酸。苯乳酸有两种对映异构体，即L-苯乳酸和D-苯乳酸。苯乳酸是一种天然抑菌物质，最初是在干酪中发现的，也存在于天然蜂蜜中，对多种病原性微生物具有抑制作用，革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、李斯特菌革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌等，但是对人和动物细胞无毒。

相比常见的化学防腐剂，苯乳酸不仅安全无毒，而且对真菌具有广谱抑制作用，且抑菌活性强于常见的化学防腐剂；相比其他生物防腐剂，苯乳酸抑菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真核微生物均有抑制作用。此外，苯乳酸溶解度高，在水中更易溶解和扩散，故能在各种食品体系中均匀扩散；稳定性强，熔点为121-125℃，对酸和热都比较稳定

目前苯乳酸合成主要有化学法和生物法两种，生物法分为酶法和发酵法。在苯乳酸生物合成过程中，苯丙氨酸通过转氨基作用生成苯丙酮酸，苯丙酮酸进一步还原为苯乳酸，此过程需要辅酶NADH的参与。

全细胞转化相比分离酶具有如下优势：全细胞生物催化剂更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化苯乳酸生产。

此前，有研究致力于在BL21(DE3)中共表达三种酶，并进行全细胞转化生产苯乳酸，但其方法存在以下缺陷：(1)大肠杆菌不是食品级微生物，大肠杆菌在发酵过程中产生的内毒素会带来新的食品安全问题；(2)以大肠杆菌作为全细胞催化剂的操作过程复杂，在其培养过程中需要添加诱导剂，并控制严格的诱导条件；(3)该大肠杆菌共表达三种酶，影响细胞生长，需要收集更多生物催化剂；(3)培养大肠杆菌全细胞催化剂时间太长，整个过程长达35h。

发明内容

本发明为解决现有技术存在的上述缺陷，提供了一种以苯丙氨酸为底物直接生产苯乳酸的方法，是以枯草芽孢杆菌为全细胞催化剂，转化苯丙氨酸生产苯乳酸。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌按照10～15g菌体细胞/20～30g苯丙氨酸的比例添加至含苯丙氨酸的反应体系中。

在本发明的一种实施方式中，所述转化是在34～37℃，转化14～20h。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌共表达苯丙氨酸脱氢酶和乳酸脱氢酶。

在本发明的一种实施方式中，所述全细胞催化剂是将所述枯草芽孢杆菌按10％接种量接到25ml发酵培养基中，搅拌转速和温度分别为220rpm、37℃，当OD₆₀₀达到23.0-25.0时，4,000rpm低温离心10-15min，收集菌体，用20mM PB(pH 7.0)缓冲液洗两遍菌体后获得全细胞催化剂。

本发明的第二个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，共表达苯丙氨酸脱氢酶和乳酸脱氢酶。

在本发明的一种实施方式中，所述苯丙氨酸脱氢酶来源于Bacillusnanhaiensis。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌168。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMK为表达载体。