[发明专利]Ran基因及其dsRNA在害虫防治中的应用

说明书

本发明提供一种昆虫Ran基因全长cDNA序列及其dsRNA在害虫防治中的应用。具体为通过生物信息学方法，从飞蝗转录组数据库中获取序列为SEQ ID NO：1的Ran基因全长cDNA序列。依据SEQ ID NO：1，设计并合成该基因的dsRNA，将其注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默靶标基因，从而使飞蝗生长发育受阻导致死亡。多次实验表明其致死率达到100%。由于本发明的特异性及高效的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义，可以为害虫防治提供新的途径。

技术领域

本发明涉及生物技术及农业害虫防治领域。具体涉及飞蝗Ran基因及其dsRNA在害虫防治中的应用。

背景技术

飞蝗Locusta migratoria，是一种洲际性的农业害虫，主要分布于亚、欧、非、澳四大洲。它具有暴发性、群集性和迁飞性的特点，一旦发生，不仅涉及面广，而且来势凶猛，致灾严重。目前在蝗虫防治工作中，仍以化学杀虫剂为主要手段，化学杀虫剂的大量使用，不仅容易导致昆虫产生抗药性，并且给生态环境带来严重污染，对人类的健康也构成威胁，因此研发绿色新型农药对我国防治蝗虫工作具有重要意义。

RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默的现象，自2006年获得诺贝尔奖以来，RNAi技术一直跻身于科技前沿。RNAi不仅是研究基因功能的有力工具，同时在害虫防治方面也具有极大潜力。通过RNAi进行害虫防治具有如下特点：1）杀虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；2）RNA在自然界极易降解，无残留；3）对环境无毒无害，相对安全。目前国际上已将基于RNAi的害虫防治称为第四代杀虫剂。筛选和鉴定对害虫生长发育至关重要的基因是应用RNAi技术开发新型杀虫剂的关键环节，因为不是所有的dsRNA都能有效的沉默靶基因的表达，也不是所有的dsRNA都能杀死害虫

Ran是小G 蛋白家族成员之一，可以在RanGDP和RanGTP两种形式之间转换，在调控核质运输、微管形成、有丝分裂的纺锤体形成及细胞分裂后核膜的组装中均起着重要作用。采用RNA干扰技术，本课题组首次证实注射飞蝗Ran基因dsRNA至5龄若虫后出现100%致死现象。因此，Ran基因可作为基于RNAi的害虫防治技术的高致死靶标基因。

发明内容

本发明的目的提供一种昆虫Ran基因全长cDNA序列及其dsRNA在致死飞蝗中的应用。

本发明提供一种飞蝗Ran基因全长cDNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。该基因全长cDNA序列是基于飞蝗转录组数据库搜索获得，该核苷酸长度为648 bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明提供飞蝗Ran基因dsRNA在害虫防治中的应用，基于飞蝗Ran基因cDNA序列，通过primer premier 5.0 软件设计含有T7启动子的上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得两端为T7启动子的模板。试剂盒纯化后按照T7 RiboMAX™ Express RNAi System（Promega）试剂盒说明体外转录合成dsRNA。通过微量注射器将合成的dsRNA注射进入飞蝗体腔内。结果表明：注射dsRNA后飞蝗Ran基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致100%的死亡。

附图说明

图1： 注射Ran基因的dsRNA进入5龄飞蝗体内24 h，48 h和72 h后对Ran基因mRNA表达的影响。β-actin为内参基因。其中*P0.05，****P0.001。

图2：注射Ran基因的dsRNA对5龄飞蝗若虫生长发育的影响。注射Ran基因的dsRNA飞蝗出现生长发育受阻并导致100%的死亡。A：左侧为注射水的对照，右侧为注射SEQ IDNO：2合成的dsRNA，即dsLmRan。

具体实施方式

实施例一：飞蝗Ran基因全长cDNA及基因片段的获得